抗病转基因绵羊胚胎生产和移植.pdfVIP

54蟋》2011年学术年会 ZT02012 抗病转基因绵羊胚胎生产与移植 刘国世1 汪锋1柴孟龙1田秀芝1 邓守龙1韩红兵1张运海3 张璐1卓志勇1徐静1张金龙2张效生2冯建忠2连正兴1 (1．中国农业大学，北京100193；2．天津市畜牧兽医研究所，天津300112； 3．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036) 摘要：【目的】建立高效的绵羊原核胚生产、人工授精，显微注射、胚胎移植转基因技术体系．同时，利用睡美 人(SIeeping like Beauty，SB)转座系统的高效性、Tell样受体(Tellreceptor，TLR)对广谱抗病能力的开关调节 作用及沉默口蹄疫病毒衣壳蛋白VPl基因表达的特性，构建抗口蹄疫病毒RNAi载体、TLR4表达栽体，通过显微注射技术 进行抗病转基因绵羊的生产．【方法l首先完成抗口蹄疫病毒RNAi靶点筛选、TLR4基因克隆、睡美人转座子结构的改造 和转座酶的优化，然后构建抗口蹄疫病毒RNAi栽体、TLR4表达载体，筛选高效的绵羊超数排卵方案，最后通过人工授精、 显微注射，胚胎移植生产抗病转基因绵羊。【结果】本研究采用CIDR+FSH减量+PMSG方案进行超数排卵，平均冲取可用原 射VPl基因(睡美人载体)后代阳性率分别为50．00％、57．14％．【结论】本研究显著提高了绵羊原核胚生产，人工授精、 显微注射、胚胎移植的效率并批量获得了转TLR4及VPlRNAi转基因绵羊． 关键词：TLR2；TLR4；抗口蹄疫病毒；“睡美人”转座系统；绵羊；转基因 引言 【研究意义】动物疫病是现代畜牧业生产的大敌，每年因疾病造成的损失约占畜牧业总产值的 12％一15％[1ie尽管通过加强饲养管理水平和应用药物疫苗能够预防一些疾病，但未能控制和消灭传染 病的流行。借助遗传育种的手段，可以从根本上提高动物的抗病性。本研究目的是获得抗病转基因羊及 提高转基因效率，其结果具有重要的现实意义。【前人研究进展】Roberts等于1932年就开始了抗病育种 工作，其试验结果表明抗白痢基因星显性，证明了抗病育种的可行性。自此人们对动物抗病育种进行了 较为系统的研究。20世纪80年代以来，随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展完善，尤其 病毒的衣壳蛋白基因(Eve)与其长末端重复序列导入绵羊的成纤维细胞基因组中，得到了3只表达Eve 基因的母羊。此外，还可以通过RNAi使易感基因沉默或直接敲除这些基因来达到抗病目的。Denning 等(2005)经细胞核移植生产出了4只敲除PrP基因的羊羔，其中1只存活了12d13】。 尽管越来越多的转基因新技术得到应用，但由于技术本身的限制，目前还没有一种转基因方法能大 幅提高转基因效率，因此，目前的动物转基因技术仍以显微注射技术为主，而影响显微注射转基因效率 的根本因素是载体的种类。 1997年，Ivics等利用生物信息学的方法，通过对鲑鱼基因组一个转座系统的分子重建，恢复了其转 座活性。由于此转座系统已失活1000万年，因此被命名为“睡美人”(SleepingBeauty，SB)转座系统【4J。 SB转座子是由一个编码转座酶的基因及两端反向重复序列(瓜)构成，全长1．6kb。转座酶基因能被其 他DNA序列代替而从SB转座子上分离下来。靠近转座酶基因的同向重复序列(DR)是高度保守序列且 特邀专题报告蟋》 55 与sB的高效转座有关【5】。转座酶是转座的催化因子，其催化外源基因整合过程如下：转座酶结合至WJDR 内的位点上；突起复合物的形成；从原整合位点切除；整合到新的靶位点【5】。自然界中的转座酶活性并 不高，可能是由于进化过程中生物体为了保证遗传物质的稳定性，避免基因的插入突变而形成的一种保 护机制。SB在脊椎动物中的效率显著高于其他转座系统【6】。它不仅能在体外培养的鱼、小鼠和人【71等大 多数脊椎动物的细胞中发生转座，还可以在动物体内介导外源基因的稳定整合和长期表达【8】，但体内的转 染效率要比体外高【9J。通过对转座子结构的改造和转座酶的优化，SB己逐步应用于转基因动物的生产。 mRNA--同注射入小鼠的单细胞胚胎，