CREG基因沉默诱导小鼠ESCs来源的EBs自发性凋亡.pdfVIP

· 1574 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 201l，27(8)：1574—1579 [文章编号] 1000-4718(2011)08—1574一o6 CREG基因沉默诱导小鼠ESCs来源的EBs自发性凋亡水 张 娜，韩雅玲 ， 田孝祥， 李 杰， 彭程飞， 闫承慧 (沈阳军区总医院，全军心血管病研究所，辽宁 沈阳 110016) [摘 要] 目的：探讨E1A激活基因阻遏子(c~／c)基因沉默诱导鼠源性胚胎干细胞(ESCs)来源的胚胎小 体 (EBs)自发性凋亡的作用。方法：应用pDS—shRNA—CREG逆转录病毒真核表达载体和绿色荧光蛋白(GFP) 的对照载体，感染鼠源性胚胎干细胞 R1，筛选获得稳定的细胞克隆(R1一shCREG和R1一GFP)；用小鼠胚胎成纤 维细胞株STO作为饲养细胞，进行 R1、R1一shCREG和R1一GFP细胞培养。倒置显微镜观察 3种ESCs的生长情 况。碱性磷酸酶(AKP)染色和小鼠心肌接种畸胎瘤形成实验检测转染后 ESCs分化情况。当ESCs生长至亚融合 状态时进行传代，去除白血病抑制因子(LIF)并悬浮培养制备EBs。用RT—PCR技术和Westernblotting方法分别 检测3组EBs培养7d时CREG和cleavedcaspase一3蛋白和mRNA的表达 ，Annexinv／P1流式细胞术检测EBs细 胞凋亡情况。结果：经pDS—shRNA—CREG逆转录病毒真核表达载体及 GFP的质粒载体转染获得稳定转染的细 胞克隆。AKP染色证实R1、R1一GFP和R1一shCREG3组 ESCs均保持未分化状态。同时，体内和体外分化研究 证实 ，Rl和Rl—GFP组细胞具有三胚层分化能力 ，小鼠心肌内注射的ESCs形成畸胎瘤组织；而R1一shCREG则不 能够形成畸胎瘤类似物，细胞分化能力降低，且细胞死亡现象增加。培养7d的R1一shCREG／EB组 CREG蛋白表 达量较R1／EB组和R1一GFP／EB组均降低；CREG的mRNA表达下降；而cleavedcaspase一3mRNA和蛋白表达均 显著升高；同时，R1一shCREG／EB细胞凋亡率明显升高。结论 ：下调CREG表达可抑制ESCs分化，促进 ESCs来 源的EBs细胞凋亡的发生。 【关键词] EIA激活基因细胞阻遏子 ；胚胎干细胞；细胞凋亡；胚胎小体 [中图分类号] R363 ， [文献标识码] A d0i：10．3969／j．issn．1000—4718．2011．08．022 CREG gene silencing inducesspontaneousapoptosisofESCs—-derived EBs ZHANGNa，HANYa—ling，TIAN Xiao—xiang，LIJie，PENGCheng—fei，YAN Cheng — hui (ShenyangGeneralHospital，CardiovascularResearchInstituteofPLA，Shenyang110016，China．E—mail：yalinghan@ gmail．con) [ABSTRACT] AIM：ToinvestigatetheeffectofcellularrepressorofE1A—stimulatedgenes(CREG)onthe spontaneousapoptosisofmurineembryonicstemcells(ESCs)一derivedembryoidbodies(EBs)．METHODS：Themurine ESCsR1wereinfectedwithpDS—shRNA —CREG andpDS—shRNA—GFPretmvirus，respectively．R1，R1一GFPnad R1一shCREGwereculturedonSTOfeedercellsinDMEM suppliedwithleukemiainhibitoryfactor(LIF)．Alkalinephos— phatase(AKP)staining