含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因组逆转录病毒载体的构建及包装.pdfVIP

· 398 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(2)：398—400 [文章编号】 1000—4718(2009)02—0398—03 含恩替卡韦耐药基 因的HBV全基 因组逆 转录病毒载体的构建及包装 项凤梅 ， 卢建溪 ， 王 强 ， 李永伟 ， 陈 伟 ， 刘旭东 ， 李 刚 (江西省中医院消化科 ，江西 南昌330006；中山大学第三附属医院 感染科，中心实验室，广东 广州 510630) [摘 要] 目的：构建含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因组逆转录病毒载体，同时进行逆转录病毒载体的包 装，为进一步产生含恩替卡位耐药基因的假病毒，进一步感染肝源性细胞，进行耐药机制的研究做准备。方法：采 用基因扩增、重组和克隆的方法，从构建好的含恩替卡位耐药基因的重组质粒中，扩增出含恩替卡位耐药基因的 HBV全基因组，然后插到pLEGFP—N1载体上，再进行重组质粒的转化 、提取、纯化和测序，然后将测序成功的重组 质粒扩大培养，并转染PT67细胞，最后通过荧光倒置显微镜观察和提取细胞培养上清进行病毒DNA提取。结果： 凝胶电泳分析血清HBVDNA扩增可见3．2kb条带，HBVDNA和 pLEGFP—N1载体连接后可见 10．1kb目的条 带，该重组质粒双酶切后可见3．2kb和6．9kb目的条带。突变前质粒测序显示含有HBV基因型为C型血清型adr 的全基因组，突变后测序证实存在 HBV逆转录酶 169、184、202、250位点的预期碱基突变。荧光倒置显微镜显示， 转染后的PT67细胞有明显的荧光表达，培养上清 DNA提取后 ，经过核酸分析仪检测，最后换算结果显示培养上清 假病毒颗粒可达 10一10／cfu。结论：成功构建了含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因重组质粒，并进行了包装， 产生了含恩替卡位耐药基因的假病毒颗粒。 [关键词] 肝炎病毒，乙型；恩替卡韦；基因组；药物耐受，病毒 [KEYWORDS] HepatitisBvirus；Entecavia；Genome；Durgresistance，viral [中图分类号] Q78 [文献标识码] A 恩替卡韦 (entecavir)是一种抑制乙型肝炎病毒 (hepatitis CGCGAGCTCT nTrI、CACCTCTGCCTAATCA一3’(下划线为 Bvirus，HBV)复制的核苷类药物，该药物具有抑制病毒效果 酶切位 点 NotI和 Spa I)。定 点突变 引物对分别为 ： 快，且不 良反应少 、产生耐药时间长且耐药发生率 比较低的 169S：5’一CATCATCT兀1GGC GCAAGACTCCTATGGGAGTG GGCCTC一3’；169A：5’一GAGGCCCACTCCCATAGGAGTCTY— 特点，但该药的二期临床试验出现2例患者病毒滴度反弹，病 — 情恶化，病毒基因测序结果是多聚酶逆转录酶区多个基因突 GCGAAAGCCAAAGATGATG一3’：184S：5’一CCGTrTCTCCTG— GCTCAGG GGTAGTGCCATITGTFCAGTGG一3’；184A ：5’一 变，且患者均已在用恩替卡韦前出现拉米夫定基因耐药 …。 — 虽然人们已经知道核苷类耐药 的基因位点主要在逆转录区， CCACTGAACAAATGGCACTACCAAACCTGAGCCAGGAGAAA． 但人们还不知道这些基因位点的突变是通过怎样 的机制引 CGG一3’：202S：5’一CCCACTGTrTGGCTITCA兀 TI．ATATGGAT— GATGTGGTATFGGG 一3’；202A：5’一CCCAATACCACATCATC—