体外连续传代培养对STO细胞生长特性影响.pdfVIP

体外连续传代培养对STO细胞生长特性的影响1 剧世强，卢晓，李冬，王一川，芮荣 南京农业大学动物医学院，江苏南京（210095 ） E-mail ：rrui@ 摘 要：饲养层细胞是分离培养胚胎干细胞所需的一类支持细胞，较为常用的有两类: 有限 系的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF ）和无限系的STO 细胞。STO 细胞能在体外长期培养，使 用方便，应用较广泛；但 STO 细胞在体外若经长期连续传代，常会产生胞质空泡、致密体 生成等异常现象，导致细胞功能发生改变，影响饲养层质量。本实验采用形态学观察、MTT 比色法和免疫荧光染色技术，对连续传代培养的STO 细胞活力生长曲线与细胞骨架分布形 态进行观察分析，实验证明STO 细胞解冻后的前9 代是用于制作饲养层细胞的最佳时间段。 关键词：STO 细胞；连续培养；生长特性；细胞骨架 胚胎干细胞（ES细胞）是一类可自我更新、无限增殖，并具有多向分化潜能的细胞。 在一定条件下，ES细胞能分化为内、中、外 3 个胚层的所有细胞类型。把ES细胞分离培养 与遗传操作、胚胎生物技术相结合，在阐明动物生长发育的基本规律，拯救和保护濒危动物， 建立先进的转基因动物生产体系等方面，都有着巨大的应用潜力。通常情况下，ES细胞的 分离培养要采用饲养层细胞来提供培养条件、促进增殖、维持其未分化状态；选择适宜的饲 养层一直是分离培养ES细胞的关键环节。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和SIM小鼠成纤维细胞 耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞) ，是目前最为常用的饲养层细胞类型。与MEF细胞 相比，STO细胞能在体外长期培养，使用方便有效[1,2]，被广泛用于培养多能畸胎瘤细胞（EC [3,4] 细胞）、杂交瘤细胞和多种动物的多能干细胞 。 尽管 STO 细胞株可在体外无限传代增殖，但长期的连续传代会对其结构与功能特性造 成影响，最终导致饲养层质量下降；STO 细胞经冻存再使用，可有效避免该现象的发生， 其原因尚不清楚，相关报道十分缺乏。为了了解 STO 细胞解冻后的生长特性变化规律，本 实验对体外连续传代培养过程中的每一代 STO 细胞进行形态学追踪观察，研究其生长曲线 与细胞骨架分布形态的变化，以期为优化胚胎干细胞的饲养层制备、选择适当的饲养层细胞 提供参考。 1 材料与方法 1.1 STO 细胞的冷冻保存与解冻 STO细胞由美国德克萨斯AM大学Piedrahita 博士惠赠，按本实验室的实验手册进行冷 冻保存。简言之，STO细胞在培养瓶中长满后，弃去含10%新生牛血清（NCS ，GIBCO产品） 的DMEM培养液（GIBCO ），以无血清、无Ca2＋、Mg2＋磷酸盐缓冲液（PBS ）洗1～3 次； 加入约6 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（SIGMA产品）于37℃消化5 min后，加6 mL含10% NCS 的DMEM培养液中和；回收细胞于离心管中并离心（1500 rpm，5 min ）去上清，最后 加入10 mL 10%二甲亚砜(DMSO)DMEM培养液，悬浮细胞后按每管1 mL分装于细胞冷冻管 中。将冷冻管放入NALGENE冷冻盒（Nalge 公司产品）中，置于-70℃低温冰箱中过夜后， 1本课题得到国家自然科学基金和江苏省自然科学基金(BK2002108)的资助。 -1- 将细胞冷冻管直接投入液氮中保存。解冻时，从液氮中取出STO细胞冷冻管，立即置于37℃ 水浴中，待冷冻液融解后缓慢加入等体积新鲜DMEM培养液，吹打混匀, 以1500 rpm 离心5 min ，弃上清，再用DMEM培养液重新悬浮备用。 1.2 STO 细胞的传代培养 解冻的STO细胞，制成单细胞悬液后，调整细胞密度，接种到预先以 0.1% 明胶包被的 培养瓶（NUNC 公司产品）中,于37℃、5 ％ CO 气相和饱和湿度的CO 培养箱中培养，记为