健康供者外周血嗜酸性粒细胞分离方法的改良.pdfVIP

第 29卷第 1期 广 东 医 学 院 学 报 V_01．29NO．1 2011年 2月 J0IRNALoFGUANGDONG MEDICALC0LLEGE Feb．2Ol1 93 健康供者外周血嗜酸性粒细胞分离方法的改良 吴智明 ，杨志刚 一，蔡静怡。 (1．广东医学院检验学院，广东湛江 524023；2．广东医学院附属医 院血液 内科，广东湛江 524001) 摘 要： 目的 探讨健康供者外周血嗜酸性粒细胞的分离方法。方法 采用PercoU密度梯度 (65％、75％)离心法，溶 血后获得的细胞悬液经终浓度为10nmol／L的N．甲酰．甲硫氨酰．亮氨酰．苯丙氨酸37℃孵育10rain预处理 ，室温 ，2400 ， 20mIn离心分离。结果 分离获得的嗜酸．I生粒细胞包膜、颗粒、细胞核清晰，细胞结构完整；存活率(99．4-I-0．6)％， 纯度(99I3±O．7)％，回收率(51．0±9．3)％。结论 本方法操作简便 ，可有效快速分离健康人外周血嗜酸性粒细胞。 关键词：嗜酸性粒细胞；分离 中图分类号：R331．1T42 文献标识码：B 文章编号：1005-4057(2011)ol一0093—03 D0I：10．3969／j．issn．1005-4057．2011．01．035 嗜酸性粒细胞(Eosinophils，EOS)是一种多向性 用三蒸水稀释至1000mL，pH7．3。两者均高压消 多功能粒细胞 ，参与多种疾病的发生 、发展和转 毒，4℃冰箱保存，备用。 归。研究嗜酸性粒细胞在其相关性疾病中作用机 1．1．4 抗凝剂 4％EDTANa2：取4．0gEDTANa2溶解 理，其分离是一个至关重要的步骤 。嗜酸性粒细胞 于100mL三蒸水，高压消毒，备用。 在正常人外周血中含量少 ，仅 占白细胞0．5％～4％， 1．1．5N．甲酰．甲硫氨酰．亮氨酰．苯丙氨酸fN．Formy1． 分离困难，所以，目前研究应用的嗜酸性粒细胞主 Methionyl—Leucyl—Phenylalanine，fMLP,Sigma—Aldrich) 要还是来 自于嗜酸性粒细胞增多患者的外周血。但 的储存液配制 取5mgfMLP先溶于2mL0．1％二甲基 这些来 自患者的嗜酸性粒细胞在功能和代谢方面有 亚砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)，再加入高压消毒 别于来 自正常人外周血的，往往达不到实验要求。 过 的1XPBS缓冲液稀释 9．427mL，形成浓度为 1 本文对 国内外报道 的Percoll不连续分离法进行改 mmol／L的储存液。取0．1mL储存液加0．9mL的1× 良，用于分离健康供者外周血的嗜酸性粒细胞，分 PBS缓冲液稀释、混匀 ，如此分装，．20℃储存，备 离效果良好，现将结果报道如下。 用。 1 材料和方法 1．1．6Percoll细胞分离液 的配制 取Percoll原液(密 度：1．131g／mL，Pharmacia)和10XPBS以9：l混合达 1．1 材料 到生理渗透压 ，此时溶液为100％Percoll，再用1X 1．1．1仪器设备 离心机 (Saitexiangyi，TDZ5．WS； PBS稀释到所需密度(75％、65％ )。 康源，LDZ5．2)，细菌过滤器 (上海市新亚净化器 1．1．7 血液来源 外周静脉血来 自5名健康志愿者 ， 厂，巾25)，过滤膜[杰瑞生物工程(上海)有限公司， 均为男性 ，平均年龄(31．2±5．4)岁，无过敏性疾病 0．22 m]，冰箱(容声，BCD一208)。 病史。每位志愿者献血25mL，白细胞分类嗜酸性 1．1．2 红细胞溶解液 氯化氨(NH4C1)8．3g