AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建和其特异性表达.docVIP

AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达 　　作者：岳殿超1， 李宝金2， 徐辉雄1， 张泷涓3， 王 瑛4， 吕明德4 作者单位：(1. 中山大学附属第一医院影像医学部， 广东 广州510080; 2. 广州市第八人民医院肝胆外科， 广东 广州518080;3. 中山大学附属第一医院外科实验室， 广东 广州510080; 4. 中山大学附属第一医院超声科， 广东广州510080) 　　【摘要】 【目的】 构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体，并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析。 【方法】 采用PCR法扩增人AFP基因启动子。回收纯化后克隆入pBluescript II KDR-TK相同克隆位点，切取AFP-TK片段，然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中，构建成pEGFP-C1-AFP-TK。对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定。【结果】序列分析表明，该启动子含300 bp核苷酸，与已报道的序列比较，100%相符。限制性酶切分析，重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子。RT-PCR及Western blotting分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后，表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达，裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61 ～ 83 ku大小的特异性条带。 【结论】 人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK构建成功。 　　【关键词】 AFP启动子; HepG2细胞; 靶向表达; 单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶1 　　Recombined and Construction of Human Alpha-fetoprotein Eukaryotic Expression 　　Vector Plasmid pEGFP-C1-AFP-TK 　　YUE Dian-chao1， LI Bao-jin2， XU Hui-xiong1*， ZHANG Long-juan3， WANG Ying4， LV Ming-de4 　　(1. Medical Imaging Department， 3. Surgery Laboratory， 4. Ultrasonic Department， First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080; 2. Hepatobiliary Department of Guangzhou 8th Hospital， Guangzhou 510060， China) 　　Abstract： 【Objective】 To construct the herpes simplex virus thymidine kinase type 1(HSV-1-TK) expression vector with alpha- fetoprotein (AFP) expression gene as starter， and analyzing its specific expression. 【Method】 The AFP promoter was amplified by means of PCR. It was purified and cloned on the cloning site of pBluescript II KDR-TK. Then the AFP-TK， fragment was obtained and inserted into pEGFP-C1 with T4 DNA ligase. The obtained fragment was identified for its cell targeting and exogenous genes expression. HepG2 genome DNA was extracted as template to amplify the AFP sequence (300 bp). Its PCR product was then conjugated with pMD-18， then amplified and extracted. The pMD-18-AFP was digested， and then the fragment was cloned into pBluescriptII KDR-TK. Then to produce the whole expressing fragment of AFP-TK which was inserted into the pEGFP-C1.