白细胞介素32(IL-32)分子克隆巨噬细胞肿瘤坏死因子α论文.docVIP

白细胞介素32（IL-32）分子克隆巨噬细胞肿瘤坏死因子α论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】结核病是一种由结核分支杆菌感染而引发的慢性肉芽肿性炎症。该病属人畜共患疾病，病原菌一旦侵染可感染人畜全身多个器官，危害极大。近年来，结核病的发病率在全球范围内一直呈上升趋势，特别是牛结核疫情的加重不仅威胁动物群体健康，更加威胁人类身体健康，因此生产转基因抗结核牛具有重大意义。目前国内转基因动物技术已达到一定水平，但选择合适的用于转基因动物的基因仍不多。本研究克隆的牛白细胞介素32（Interleukin-32，IL-32）基因是近年发现的一种新型功能基因，其主要作用是诱导其他细胞因子和化学因子的产生，并在自身免疫性炎症性疾病中发挥重要作用。目前已经发现IL-32具有抑制结核分支杆菌（Mycobacterium）等多种分支杆菌感染，提高动物机体抗病能力的作用。结核分枝杆菌可以从人类单核细胞和巨噬细胞中通过半胱天冬酶-1/IL-18/Interferon-γ-依赖机制诱导IL-32的产生，在人巨噬细胞中，IL-32的高表达，可显著降低宿主细胞内结核杆菌的存活率。本研究分析了牛IL-32β在秦川牛不同组织中的表达情况，牛IL-32β在秦川体内主要分布于脾脏和肾脏，其他组织目前尚未发现。并从秦川牛脾脏中分子克隆了牛IL-32β基因的可变剪接体牛IL-32γ基因，序列分析表明，牛IL-32γ比牛IL-32β序列多了第二个内含子，从而导致编码序列多编码47个氨基酸。构建牛IL-32γ的原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出该蛋白，摸索蛋白表达条件，IPTG浓度为1mg/mL，温度为28℃时，表达效果较好。成功的表达该目的蛋白为制备多克隆抗体打下了一定基础。为制备其单克隆抗体提供参考。为了进一步研究该可变剪接体的功能，本研究构建了真核表达载体pIRES-IL32γ-GFP，将该载体稳定转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7，得到超表达牛IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞系，同时以稳定转染人IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞为阳性对照，Real-time PCR检测表明，超表达IL-32γ的细胞具有调节IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子表达的功能，其趋势与阳性对照人IL-32γ的趋势相近。。本研究为进一步研究牛IL-32γ基因生物学功能提供了重要依据。 【关键词】牛；白细胞介素；32（IL-32）；分子克隆；巨噬细胞；肿瘤坏死因子α； 【篇名】牛白细胞介素32基因β、γ亚型的分子克隆与功能验证 【目录】牛白细胞介素32基因β、γ亚型的分子克隆与功能验证 摘要 6-7 ABSTRACT 7-8 文献综述 12-20 第一章 白细胞介素 32 基因研究进展 12-20 1.1 IL-32 的生物学特性 12-13 1.1.1 IL-32 的来源 12 1.1.2 IL-32 的亚型 12-13 1.2 IL-32 的生物学功能 13-15 1.2.1 IL-32 诱导细胞因子产生炎症反应 13-15 1.2.2 IL-32 介导 T 细胞凋亡 15 1.3 IL-32 的受体及信号转导 15-16 1.4 IL-32 与疾病发生 16-20 1.4.1 IL-32 与类风湿关节炎 16-17 1.4.2 IL-32 与克罗恩病 17 1.4.3 IL-32 与癌症 17-18 1.4.4 IL-32 与流感 18 1.4.5 IL-32 基因与结核菌 18-20 试验研究 20-55 第二章 牛白细胞介素 32 基因Β、Γ亚型的序列分析与分子克隆 20-35 2.1 试验材料 20-22 2.1.1 试验用组织、工程菌及载体 20 2.1.2 试验用主要试剂及工具酶 20 2.1.3 试验用主要仪器与设备 20-21 2.1.4 主要试剂配方 21 2.1.5 分子生物学与生物信息学软件、数据库、网站 21-22 2.2 试验方法 22-27 2.2.1 数据库中牛白细胞介素 32 基因的序列比对 22 2.2.2 牛白细胞介素 32 基因的分子克隆 22-27 2.2.3 牛 IL-32β的组织表达特异性分析 27 2.2.4 牛 IL-32 基因生物信息学预测与分析 27 2.3 试验结果 27-33 2.3.1 牛白细胞介素 32 基因的序列分析 27-29 2.3.2 牛白细胞介素 32 基因的分子克隆 29-30 2.3.3 牛 IL-32β的组织特异性表达 30-31 2.3.4 牛 IL-32 基因生物信息学分析 31-33 2.4 讨论 33-34 2.5 小结 34-35 第三章 牛白细胞介素 32 基因的原核表达