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中国畜牧兽医学会中兽医学分会2011年学术年会论文集
藿香对高温应激引起的IEC.6细胞凋亡的调控2
余进2,王 宁2, 许剑琴p,刘风华1+
贾丹1,栾伟丽1,侯晓林1,钟友刚2,郭凯军1,
1北京农学院动物科学学院,北京,中国,102206
93
2中国农业大学动物医学院,北京,中国,1001
l引言
凋亡(细胞程序性死亡)是机体生命进程的重要组成部分,它可以调节细胞数目以及种类、消除损
伤的细胞,凋亡在维持细胞稳态、促进机体发育以及诸多疾病中都有重要的作用【lJ。研究发现很多因素
可以引起细胞产生凋亡,如高温、缺氧、射线,氧化应激等等。藿香具有清热泻火、解表和中、燥湿健
脾的功效,是临床上常用的一类中药,用于动物在夏季高温高湿环境中感受暑湿之邪后出现的暑热挟湿
证。研究表明,高温会诱导离体细胞发生凋亡伫,31,本实验室前期研究表明对热应激能引起肠道的组织
发生损伤14,5],热应激能使IEC.6细胞的抗氧化机能受损16],影响活性氧的产生,进而使线粒体膜的通透
性发生改变,影响细胞的正常机能。本文在实验室前期研究的基础上针对高温中IEC.6细胞凋亡的影响
开展相关实验,采用荧光染色技术观察细胞的形态学变化、流式细胞仪检测细胞的凋亡率、RT-PCR检
测凋亡相关基因。探讨热应激对IEC.6细胞的凋亡情况的影响。
2材料与方法
2.1材料
细胞株:IEC.6细胞株(CRL21592),购自中国协和医药科技大学细胞保藏室。
药品:藿香挥发油包合物(百秋里醇含量30.47%),中国中医科学院基础研究所:DMEM培养基, 注射用硫酸链霉素,中国华北制药股份有限公司,批号0405071DMSO中国北京科昊泽生
物技术有限公司,Amresc00231分装;溴化乙锭,中国北京科吴泽生物技术有限公司,Amresc00492
V-PI细胞凋亡检测试剂盒。
分装;吖啶橙,sigma公司,批号A60141凯基Annexin
主要仪器单人双面净化工作台,中国苏州净化设备有限公司;二氧化碳培养箱,日本SANYO,
MCO一18AIC。
2.2细胞处理
倒置显微镜下进行细胞计数和细胞活力计算后,调整细胞浓度为l×105
胞悬液到于96孔细胞培养板,后置于5%C02培养箱中培养。
藿香组提前44h加入藿香挥发油(浓度200≥g/mL)。
高温组和藿香组细胞热应激条件为42(2,4h。
2.3荧光染色
2瓷金项目:国家叶二五懈技支撑计划重点项目(201
北京市属高等学校人才强教计划资助项目、教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助资助。
通讯作者刘风华,.1iufendaual209@1 2壹;Q圃
26.com:.许剑琴,I如qi盛嵫丛@1
276
中因畜牧善医学会中兽医学分会2011年学术年会论文集
灭菌干净的盖玻片放八六孔板中,再加入传代的细胞,37C,5%C02中培养,待细胞贴满板底的
I I配成的终浓度为I%染液上,避光染色】0mln,荧光显微镜下照相.AO用蓝色激发光发显示绿色.
EB用绿色激发光显示红色,后期做图像叠加处理。
2.4流式细胞仪检测细胞调亡奉
x
高温刺激后胰酶消化收取细胞值日胞自细胞培养板中取出后,收入I5mL离心管中2000rpm5rain
Iodide,混匀,室温下避光反应15min。使用未经凋亡诱导处理的
V-FITC混匀后,加入5山Propidium
细胞作为对照,进行荧光补偿的调节,激发波长Ex--488nm;发射波长Em-530/)m,流式细胞仪检测.
用Multicycle软件分析细胞凋亡状态。计算早期和晚期细胞凋亡率(%)。
2.5RT-PCR检涓凋亡基因
将处理后的细胞,弃去培养基并用PBS冲洗2次,
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