HaSNPV几丁质酶基因原核表达、纯化与复性研究.pdf

摘 要 撼铃虫核型多角体病毒楚我国第一个裔晶病毒杀虫剂，其有僮用安全，害虫 不产生抗性等优点，是一种徽有发展潜力的可替代生物农药。目前中国棉铃虫单 粒包埋型核型多角体病毒(HasNPⅥ的基因组序列已经测廖完成，在HasNPv基 因缀中发现了18家族凡丁质酶盼穿到，该凡丁质酶基因是一个晚精菲必需基西。 由于HasNpV几丁质酶基因与受染虫体液化和病毒侵染机制密切相关，因丽该 基因的硪究躁羹号l起了人们蛇重视。 在本研究中我们将翻除了N端20个氨摹酸的信号欣和C端4个氨基酸的内质 网定位序列的HasNPV几丁质酶基因构建到高效原核表达载体pE就8a(+)中，经测 序捡骏后，转化表达露主楚歌osel鹾DE3)，以lpTG巍诱导舞#诱导表达。最佳撑％ 诱导浓度为O．5mM，最佳诱导时间为3h以上，(1Iis)6．ch认蛋白可占总蛋白的 u 22．6％，1mL菌液约含(Hi咄一ch认蛋臼65g，但是(His玲chiA蛋自主要以包涵体 的形式表达。为了得到可溶憋蛋自，我们还将狂aS将·v酌凡丁缀酶基函稳建到 pMAI，c2x载体中，pM觚载体特剐有利于外源蛋白的正确折叠，从而形成可溶 性的蛋白。MBP．chiA融合蛋囱可占总蛋白的14。7％，lm撼液约含M转P-穗後蛋 旧没有获得有活性的蛋白，但为进一步的研究奠定基础。 奁本研究中我们大量培养含凌pET28《+)一c艇A鏖粒戆鬏。se蛙《D粥)，诱导表 达，l|雯集包涵体蛋自，对箕进行初步洗涤纯化，然后用8M尿素溶解，在变性条 件下(8M尿索)经镍．次氮基三乙酸(Ni—NTA)柱进行亲和层柝纯化，得到鲍电 溶缝的重缌几丁质酶蛋自，纯度霹达95％以上。然后，我们采用了逐步透析辅方 法对毫泳缝的包涵体蛋自进行复往，于4℃分别对100IIlL尿素浓度依次为 为28％，lmg复性螽蛋鑫抟活性为O．3u。我们莲I采翔了柱上复性豹方法对包涵 体谶行复憔，依次以含有6M。5M4M．3M．2M．1M，OM尿素的Iefoldingbu酊e￥的 缓冲液洗楗，碍到了活性蘑组几丁质酶蛋自，复性效率约为43％，l蕊鬈复性蜃蛋 自的活性为0，5u，北方法哥实糯蛩自的阏时统纯及复往。 关键词：HaSNPV几丁质酶原核表达蛋白纯化复性 H Abstract 肌舭一v8伊口n瑚喀e，4 been for contml thefirstisolationofthis ttle extcnsivelyusedofH口，研培P加since ofehina．飘e o￡斑is证ms genome h勰bee魏com出嘲y patbgc珏主n}轴ki翠ovince a藏d鑫chi蛀nase 18拣i娃naseswaside矬ti蠡ed，’nle seque珏ced gonebelonginglo氢璐矗y tobe in cadaVers． cllitinasewasfoundessential infected liquefying chitinasefromHasNPVwasconstnlctedinto Vector gene expressionpET28a(+) and啦ent端ns托ll它di珏to lmst was to Rosetta(DE3)，whichdesigned expression e曲鞠ee explessi陇0f nechjlinaseWas asafusion a gene suc