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医学微生物学实验论文 PCR方法快速检验HBV 2006年12月29日 PCR方法快速检验HBV [日期：2006-12-29 ] 作者： 刘晓林 王远贺 王瑞静 青岛大学医学院04级六班 　 【摘要】 乙型肝炎的预防、检测和治疗变的尤为重要。 ①模板DNA的变性：模板DNA与引物的退火(复性)：引物的延伸：标准的PCR反应体系：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。标准的PCR反应体系： 　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　100ul 本次实验的PCR反应体系： 试剂名称 试剂量 终浓度 10xbuffer 3.0μl 1xbuffer 10xdNTP 3.0μl 0.2μM 25mM MgCl2 1.8μl 1.5mM Primer1 0.6μl 0.5μM Primer2 0.6μl 0.5μM DNA template 2.0μl 1.0ng Taq DNA polymerase 0.3μl 1.5U Pure ddH2O 18.7μl 合计 30.0μl 本次实验的PCR反应循环参数： 94℃ 5min 94℃ 1min 3℃ 1min 30个循环 72℃ 1min 72℃ 10min 四、实验准备 【实验材料】 引物：5`—TGACAAGAATCCTCACAATA—3` 5`—AGCCCTACGAACCACTGAAC—3 PureddH2O 10xbuffer 10xdNTP 25mMMgCl2 TaqDNA聚合酶 溴酚蓝 溴化乙锭 TBE缓冲液 琼脂糖 标号“7”的阳性标本一份 标号“8”“9”的待测标本各一份（由老师提供的待检人员的血清DNA提取液） 标号“—”的阴性标本一份 【实验仪器】 PCR扩赠仪 水平式电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像分析仪 微量加样器等 五、实验步骤 1、取一支Eppendorf管，按如下顺序和计量，依次加入。 Pure ddH2O 112.2μl 10xbuffer 18μl 10xdNTP 18μl 25mM MgCl2 10.8μl primer1 3.6μl primer2 3.6μl