蒙古马毛色性状相关基因多态性分析及组织表达的研究.pdf

摘 要 动物毛色基因研究是毛色遗传学研究的重要内容，毛色不仅是马品种和个体识别 的重要依据，而且还可以作为某些疾病筛查的有力工具和手段。开展马毛色基因的遗 传学研究不仅具有理论意义，更具有特殊的经济价值和人文意义。蒙古马是我国最古 老的品种之一，其毛色种类繁多，是研究马毛色遗传的最佳模式动物。本研究以不同 类群蒙古马为实验对象，首先对蒙古马MC1R基因、ASIP基因、TYRP1基因和STX17 基因进行多态性检测，找出与毛色表型相关的基因位点，并对位点间的遗传效应进行 了剖分；其次采用实时荧光定量PCR （QRT-PCR ）的相对定量方法对蒙古马MC1R基 因、ASIP基因、TYR基因、TYRP1基因、TYRP2基因和STX17基因在不同毛色皮肤、 肝脏、垂体和肾脏组织中差异表达进行了研究；最后制备了MC1R蛋白和ASIP蛋白的 特异性多克隆抗体，采用蛋白免疫印迹技术对蒙古马MC1R蛋白在不同毛色蒙古马皮 肤和垂体组织的差异表达进行研究。通过以上研究，为蒙古马毛色遗传研究提供了重 要的理论依据，并获得以下主要研究结果： （1）分别采用PCR-RFLP 、PCR-AFLP和PCR-SSCP技术分别对蒙古马MC1R基因 E位点、ASIP基因A位点和TYRP1基因B位点进行了遗传多态检测。研究结果表明 MC1R基因在编码区第901bp处碱基发生C→T错义突变，该突变导致编码的氨基酸由 丝氨酸突变为苯丙氨酸；ASIP基因在第二外显子2174-2184bp处发生碱基缺失突变； TYRP1基因在第二外显子189bp处碱基发生C→T错义突变，该突变导致编码的氨基酸 由苏氨酸突变为蛋氨酸。 （2 ）通过各多态位点与蒙古马毛色表型相关性分析得到，MC1R 基因 E 位点的 隐性纯合型与蒙古马栗色毛的形成具有较强的相关性，ASIP 基因 A 位点的隐性纯合 型与蒙古马的黑色毛具有较强的相关性，TYRP1 基因 B 位点主要与毛色的深浅及有 色毛的形成有关。 （3 ）半巢式PCR扩增结果表明，在灰色蒙古马中均检测到了STX17基因第六内 含子处4.6kb 的重复片段，而在非灰色马中未检测到，证明STX17基因与蒙古马的灰 色毛形成可能具有相关性。 （4 ）采用NOIA模型对蒙古马MC1R基因E位点与ASIP基因A位点对皮肤反射系 数影响的遗传效应和遗传方差进行了剖分。从剖分结果得到8个遗传效应组分均对蒙 古马皮肤反射系数具有显著的影响；经过分析发现蒙古马MC1R基因与ASIP基因间不 但具有显著的上位效应，并且具有拮抗作用，二者共同作用影响着毛色表型的形成； 通过遗传方差剖分证明蒙古马的毛色性状主要由MC1R和ASIP基因的遗传效应所决 定，环境效应影响不大。 （5 ）采用QRT-PCR 的2-△△Ct 方法对蒙古马MC1R基因、ASIP基因、TYR基因、 TYRP1基因、TYRP2基因及STX17基因在不同毛色皮肤、肝脏、垂体和肾脏组织进行 了差异表达研究。结果表明各基因在所有组织中均有表达；对于皮肤组织，MC1R基 因、TYR基因、TYRP1基因和TYRP2基因均在有色毛皮肤组织中的表达量较高，灰色 毛皮肤组织中的表达量最低；ASIP基因在骝色毛皮肤组织中的表达量最高，STX17 基因在灰色毛皮肤中表达量最高，二者均在黑色毛皮肤组织中的表达量最低。表明 MC1R基因和酪氨酸酶家族基因是影响深色系毛色形成的主要候选基因，STX17基因 是浅色系毛色形成的主效基因；ASIP基因与深色系毛色和浅色系毛色的形成均具有 相关性。从各基因的差异表达情况可以看出ASIP基因与MC1R基因以及酪氨酸酶家族 基因互为抑制。 （6 ）采用多肽合成抗原及原核表达外源蛋白的方法制备了 MC1R 基因和 ASIP 基因的特异性多克隆抗体，并采用蛋白免疫印迹的方法对 MC1R 蛋白在不同毛色蒙 古马皮肤和垂体组织中的表达量进行了半定量检测。结果显示 MC1R 蛋白在黑色毛 皮肤组织中表达量最高，在灰色毛皮肤组织中表达量最低；在黑色毛垂体组织中表达 量最高，在灰色垂体组织中表达量最低。 关键词：蒙古马；毛色；多态性；遗传效应；差异表达；实时荧光定量 PCR ；多克 隆抗体；蛋白免疫印迹 The Study on Polymorphism Analysis and Tissue Expression