感染BmNPV家蚕中肠组织cDNA文库的构建.pdfVIP

感染BmNPV 家蚕中 组织cDNA 文库的构建 1 1,2* 1,2 1,2 1 1 2 管蕊 沈中元 唐旭东 徐莉 朱峰 陶恒平 陈大睿 1 2 （中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江2120 18； 江苏科技大学生物与应用化学学院，江苏镇 江212018 ；） 摘要：为了探索家蚕核型多角体病 （BmNPV ）蛋白间的相互作用，采用CLONTECH SMART (switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术，在酵母菌株Y 187 构 了感染BmNPV 家蚕 肠组织的cDNA 文库。家蚕五龄第三 天添食BmNPV，提取感染后12 小时与96 小时家蚕 肠组织的总RNA 并混合均匀。利用经修饰的CDSⅢ引物合成 cDNA 第一链，在反应体系 再加入SMARTIII-modified Oligo 作为cDNA 第二链合成的引物，进行长距离LD-PCR 合成双链cDNA，后者经CLONTECH CHROMA SPINTE-400 柱纯化后，与线性载体质粒pGADT7-Rec 共转化入感 受态酵母菌Y 187 ，二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性，进行同源重组产生环形有复制活性的文库质粒， 然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆，即为感染BmNPV 家蚕 肠组织的cDNA 文库。实验结果表明： 提取RNA 的A260/A280= 1.82，纯度较高；双链cDNA 文库大于0.2 kb，且弥散较长，成瀑布条带状；该文库具有基 因多样性和足够大的库容量，共获得6.8×108 转化子，滴度为4.4×107cfu/ml ，文库扩增后，插入cDNA 的平均长度 为750 bp ，文库的重组率为95% 。该文库的构 为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础。 关键词：家蚕NPV；酵母双杂交；cDNA 文库 cDNA library construction of BmNPV infected silkworm GUAN Rui 1 SHEN Zhong-Yuan 2,* TANG Xu-Dong2 ZHU Feng1 1 CHEN Da-rui (1J iangsu University of Science and Technology, Zhenji ang 212018 China 2Sericultural Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Zhenji ang 212018 China) Abstract： In order to explore the protein interaction between Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) and its host, cDNA library from the BmNPV infected silkworm was constructed by CLONTECH SMART technology. Methods: silkworms larvae on the third day of the fifth instar were challenged with 109 BmNPV polyhedron. Total RNA of midguts at 12 and 96h p.i. was extracted respectively and mixed well. The first chain of cDNA was transcripted with a