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CYPC基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性.ppt
CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究 主要内容 第一部分 研究背景 丙戊酸钠(Sodium Valproate, VPA) 一线抗癫痫药,目前仍无法取代 可用于多种类型的癫痫发作 CYP2C19最主要的两个突变位点 CYP2C19*2:第5外显子681位 G→A CYP2C19*3:第4外显子636位 G→A 基因型鉴定:聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP) PCR:模拟体内DNA复制条件,体外酶促合成特异DNA片段的循环反应,以扩增目的DNA。 RFLP:某种限制性内切酶特异性识别位点,对DNA切割; 基因突变时特异性酶切位点消失,不被限制性内切酶切断; 利用电泳检测,观察条带分析基因型。 PCR-RFLP特点:操作简便,耗时耗费低 本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性 第二部分 实验方法 一、数据收集 2008年9月至2009年4月 第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部 服用丙戊酸钠的癫痫患者49例 筛选资料齐全的30例 记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血药浓度、合并用药等情况。 二、血药浓度检测——荧光偏振免疫法(FIP) 美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒 服用丙戊酸至少5个半衰期(2-2.5天)后,血药浓度达稳态时,于下次服药前,采抗凝静脉血4ml。 离心,取上清液(血浆)100μl,进样测定。 三、基因型鉴定 1、提取DNA: 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒 提取所收集血样DNA 北京六一仪器厂DYY-II2型电泳仪和电泳槽 DNA样品电泳检测 紫外灯下判读结果,照相存档 2、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 2.1 PCR反应 德国Eppendof公司PCR扩增仪 设计并合成CYP2C19引物: CYP2C19*2:前引物F 5’-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3’ 后引物R 5’-ACAAATACGCAAGCAGTC-3’ CYP2C19*3:前引物F 5’-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3’ 后引物R 5’ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’ 建立反应体系: 蒸馏水9 μl 前引物0.5 μl,后引物0.5 μl HotStar Taq Master Mix 12.5 μl(包含4种dNTP,Mg2+,Taq DNA聚合酶,以及Tris·Cl-KCl缓冲液) DNA 模板2.5 μl PCR反应条件: CYP2C19*2:94℃预变性15min→94℃变性40s→51℃退火30s→72℃延伸30s 循环35次,最后72℃延伸10min。产物长度458bp CYP2C19*3:94℃预变性15min→94℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸30s循环35次,最后72℃延伸10min。产物长度233bp。 PCR产物电泳检测 紫外灯下判读结果,目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验 照相存档 2.2 限制性长度多态性(RFLP) 美国New England Biolabs公司内切酶SmaI 、 BamHI 酶切反应: CYP2C19*2:用限制型内切酶SmaI30℃消化3h。SmaI酶切条件:PCR反应产物10ul;水16ul;10×Buffer 2ul;SmaI 2ul。 CYP2C19*3:用限制型内切酶BamHI37℃消化3h。BamHI酶切条件:PCR反应产物10ul;水18ul;10×Buffer BamHI 2ul;BamHI 1ul。 酶切产物电泳检测 紫外灯下判读结果,通过条带数目及位置,判断基因型 照相存档 3、基因测序 取前引物6μl,与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列 四、数据分析 Spss 12.0 standard version(Spss Inc.) 用双侧t检验和χ2检验。P﹤0.05为差异有统计学意义 第三部分 实验结果 一、病人一般情况和治疗情况 男20例,女10例,男女比例2:1 平均年龄33.6±24.60岁,平均体重56.15±18.50kg 丙戊酸钠体重剂量范围2.3-27.7mg/kg·d,平均值为11.74mg±6.10/kg·d 血药浓度范围7.97-89.96μg/ml,平均值为44.59±27.60g/ml 二、血药浓度监测情况 测定血药浓
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