利用InFusion技术构建存活素增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体.docVIP

利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 作者：林朝贵　范林　陈良龙 作者单位：福建医科大学附属协和医院心内科，福建 福州 350001 　　【摘要】 目的：本研究以构建存活素-增强型绿色荧光蛋白(Survivin ＆ eGFP)融合基因慢病毒表达载体（p-GCFU-Survivin）为例来探讨In-Fusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。方法：根据In-Fusion技术原理，克隆引物设计时，在Survivin同源序列的两侧分别引入经Age I线性化的载体p-GCFU两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（PCR）产物与线性化p-GCFU用In-Fusion交换酶在室温下作用30min，使Survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2Μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293T细胞，观察Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达。结果：每2Μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染p-GCFU-Survivin可获得Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达。结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。 　　【关键