近代-复习总结.docVIP

1. syber green 定量PCR原理 荧光定量PCR 技术的两种检测模式： SYBR Green I 检测模式和解探针模式。 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA 结合后，其荧光大大增强。PCR 温度循环为94～55～72℃三步法，只有引物，无探针，荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR 荧光染料仅有微弱荧光信号背景。该方法通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。此外，由于一个PCR 产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBR GreenⅠ的检测灵敏度很高。但是，由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR GreenⅠ Real-Time PCR 定量结果。 2.如何用syber green 定量一个样品，ct值定义，与初始模板浓度的关系 所谓的实时荧光定量PCR，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的