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3-氰基吡啶微生物转化产物的高效液相色谱分析 李文忠 （中国科学院微生物研究所，北京，100080） 〔提要〕本文研究了3-氰基吡啶微生物转化产物的反相高效液相色谱RP-HPLC）分析方法。采用径向加 压C18分离柱和甲醇-H2O2080为流动相，在研究选定的流动相速度梯度色谱条件下，底物3-氰基吡啶和产物 尼克酰胺、尼克酸得到了全分离，其最低检出量分别为110-9、l.510-10和1.010-10g。此法分析周期短，重 现性好，操作简便，可同时完成底物和产物的分离分析，适用于批量微生物样品的分析。 3-氰基吡啶(3-Cyanopyridine)为杂环芳香腈化 （三）3-氰基吡啶微生物转化产物溶液的制备 合物。这种化合物可被具有芳香腈水合酶(Aromatic 以3-氰基吡啶为底物，采用腈化物降解菌静止 nitrile hydratase)、芳香酰胺水解酶(Aromatic ami- 细胞进行反应，获得含转化产物的混合液，离心取上 dase)或芳香腈水解酶 Aromatic nitrilase）活性的微 清液供测定用。 生物催化转化生成尼克酰胺Nicotinamide）和尼克 （四）分离柱及流动相 酸Nicotinic acid。尼克酰胺和尼克酸均为抗糙皮病 3-氰基吡啶⒛尼克酰胺和尼克酸的极性顺序为 维生素(Vitamin PP)，也可作为医药和动物饲料添 3-氰基吡啶＜尼克酰胺＜尼克酸。因此，可采用非极 加剂等，具有很大的应用价值。 性分离柱反相色谱进行分离分析。在室温条件下，选 关于以3-氰基吡啶为前体用化学合成法生产尼 用分辨率高的C18径向加压柱（Radial-Pak Cartridge 克酰胺和尼克酸的工艺已有报道 。近年来已开发 -Bondapak C18,0.8 10cm，10，WatersUSA），并 成功了应用生物工程技术转化3-氰基吡啶生产尼克 以甲醇-水混合液为流动相。 酰胺和尼克酸的新工艺，对底物（3-氰基吡 ）的转 （五）UV检测波长 化率和产物（尼克酰０胺和尼克酸）生成量的分析，需 上述所试三种化合物分子中均含有相同的杂原 采用两种不同分析系统的高效液相色谱HPLC）来 子芳香环及相似的不饱和键，在紫外区的特征吸收 完成［2］ 峰分别为254.5、254.5和257.5nm，因此选定254nm 本文对3-氰基吡啶及其微生物转化产物尼克酰 为UV检测器的使用波长。 胺和尼克酸的分析方法进行了研究，选择确定了可 在单一的反相HPLC分析系统中快速完成上述三种 结果和讨论 物质的定量测定。 （一）色谱条件的选择 1．流动相流速对组分分离柱效的影响 以甲醇 实验部分 ：水＝20:80混合液为流动相，分别测定了3-氰基吡 （一）仪器与试剂 啶、尼克酰胺和尼克酸单一组分在不同流动相流速 M201高效液相色谱仪（Waters,USA┡配有自动 条件下相应于各组分的柱分离理论塔板高度（H） 梯度控制器（M680、可调波长UV检测器（M481） 结果表明，所试三种组分的柱分离效率最高处（H 和数据处理器（M730等。DU-7HS紫外分光光度计 最小）的流动相流速分别为2.5、2.0和1.5ml/min，即 BeckmanUSA） 各组分在分离柱上获得最大分离效率所需流动相流 3-氰基吡啶、