结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定.pdfVIP

中国人兽共 患病学报 104 ChineseJournalofZoonoses 201l，27 (2) 文章编号 ：1002—2694(2O11)02～0104—04 结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定* 赵善民，江 鹰，赵 勇，毛峰峰，张彩勤，郭晓雅 ，白 冰，师长宏 摘 要：目的 构建结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)RpfA 的原核表达质粒，并在大肠杆菌 中表达、纯 化和鉴定 。方法 用 PCR方法从结核分枝杆菌 H37Rv基 因组 中扩增 出编码 RpfA蛋 白的Rv0867c基 因，通过克隆载体 pMD18-T构建质粒载体 pMD18T—Rv0867c。经酶切和 DNA序列测定证实正确后 ，将 Rv0867c基 因克隆到 pET32a(+)载体 并在大肠杆菌 BI21中诱导表 ，表达产物经SDS—PAGE和 Westernblot鉴定后 ，用 Ni—NTA亲和层析柱进行纯化。结果 双 酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符 ，测序结果与文献报道一致。Westernblot结果显示 ，在相对分子量约 102kDa处 有分别与 AntiHis单抗、Rpf结构域单抗和 TB病人血清特异性结合带。结论 成功表达 、鉴定和纯化 了RpfA蛋 白。 关键词 ：结核分枝杆菌；RpfA；表达 ；鉴定；纯化 中图分类号 ：R378 文献标识码 ：A Expression，identificationandpurification ofRpfA proteinfrom M ycobacterium tuberculosis ZHAO Shan—min，JIANG Ying，ZHAO Yong，MAO Feng—feng， ZHANG Cai—qin，GU()Xiao—ya，BAIBing。SHIChang—hong (LaboratoryAnimalCenteroftheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，China) ABSTRACT：ToconstructtheRpfA expressionplasmidofMycobacterium tuberculosis，andtoexpressand purifythefu— sionproteininE．coliBI21，theRv0867cgenewasamplifiedbyPCR from genomicDNA ofMTBH37Rvstrain，andclonedin tothevectorpMD18一T．ThenRv0867cwassubclonedintotheexpressionvectorpEI、32a(+ )afteridentifyingbyrestricteden— zymesdigestionandDNA sequencing．Theconstructedrecombinantplasm idwastransformedintoE． foliBI21，andexpressed therecombinantprotein．TheexpressedproteinwasidentifiedbySDSandW esternblot，andtherecombinant6×His fusedproteinwaspurifiedbyNi—NTA purificationsystem．ThesizeoftheRv0867cgenedigestedbyrestrictedenzymesaccor dedwiththetheoreticalsizeandtheDNA sequencewasidenticaltothereportedonein literatures ． Asrevealed bvW estern— blot，aspecificbindingband couldbedetectedatsitewhererelativemolecularmass