热源及热源检测 .ppt

热原及热原检测的历史 主要内容 1、热源的发展 2、内毒素 3、鲎试剂及目前我们常用的检测方法 4、内毒素的预防及去除方法 热 原 韦伯斯特字典中的定义热原为: “致热剂” 当热原进入血液循环系统时会产生发热反应。 静脉疗法的历史与热原研究的历史是息息相关的。 静脉疗法与发热 在 18 和 19 世纪，实验医学界充满着关于静脉输注疗法的报道。 所有的病人注射后都伴随有发热反应 当时的医生和科学家都深信这种发热对人体有益。 注射发热 1912 年两个英国科学家 Hort 和 Penfold 确立了注射发热的真正本质: 利用兔子使发热检测方法标准化 将细菌分为热原和非热原两种类型: 革兰氏阳性 革兰氏阴性 蒸馏水的热原性是与细菌数量相关联的 总结出所有注射发热都是由于可滤过的、遇热稳定的革兰氏阴性细菌物质造成的。 注射发热 Florence Seibert，一个美国科学家: 1923 年至 1925 年之间她证实了所有的注射发热都是由可滤过的、热稳定的革兰氏阴性细菌物质造成的。 建立了一种可以稳定地生产静脉注射溶液的方法，且生产出来的注射液通过兔法检测合格。 革兰氏阴性细菌内毒素 是革兰氏阴性细菌最外层细胞壁的产物 高分子量脂多糖复合物: 单体的分子量介于 10,000 至 20,000 道尔顿之间. 通常以 100,000 至 500,000 道尔顿的聚合体存在 特征: 普遍存在于自然界中 致热效力极强 耐受: 次微米的过滤 蒸汽灭菌 其灭活可通过: 干热过程 碱性条件 脂多糖的化学成分 含有三个截然不同的区域: 区域 I:类脂 A 区域 II: 核心多糖 酸性糖质的高度守恒区域，连接 O-特异性侧链与类脂 A 区域 III: O-特异性侧链 胡须状凸起，构成革兰氏阴性菌的 O 抗原 极其不稳定 兔热原检测法 动物物种的选择: 便宜 容易处理 具有易变的体温调节机理 需要测量三只兔子的直肠温度: 在静脉注射前 在静脉注射了检测溶液后 兔实验法 在注射前 15 min 测定原始体温 每隔 30 min 监控体温持续 3 h 合格标准: 没有兔子的个体体温升高 0.6℃ 或 0.6℃ 以上；或 3 只兔子体温升高均低于 0.6℃ ，且体温升高的总和低于 1.4℃ 复测: 增加 5 只兔子供实验 体温升高 0.6℃ 的兔子仅有 1 只 8 只兔子的个体体温升高总和不超过 3.5℃ 鲎实验法 该诊断试剂是使用美洲鲎的阿米巴细胞的溶胞物制备的: 因此取 Limulus Amebocyte Lysate 的首字母缩写为 LAL 1〉放射性药品寿命短，无法用兔法检测 2〉证明鲎试验比兔法对内毒素灵敏 10 倍 RSE/CSE 进行初次验证实验需要 EU/ng 比率 每个 LAL 和 CSE 的组合都需要该比率进行实验 不同批号的试剂与标准品组合的 EU/ng 比率有差异 细菌内毒素及除热原 除热原方法包括： 去除 灭活 去除内毒素的方法 冲洗 蒸馏 反渗透 超滤 静电吸引 活性炭 色谱法 去离子床 沉淀/澄清 冲 洗 除热原的最简单方法 使用达到注射用水质量的水。 适用于低水平的热原污染 特别适用于: 器械组件 塞子 增加能量提高效率的方法: 加热 超声波降解法 蒸 馏 此方法水会经过两种状态的变化: 从液态到气态 从气态到液态 隔膜装置系统和地心引力阻止了大分子量的 LPS 转变为气态。 反渗透 是 USP 认可的两种生产注射用水(WFI) 的方法之一 孔的名义额定尺寸大约是10 ?。 典型的滤膜材料为： 醋酸纤维素 聚砜 复合薄膜（TFC）聚酰胺 TFC 膜的有效率达到 99.9% 超 滤 按分子量大小进行排除的过滤器 基于斯托克斯半径（分子半径）的原则 大小是由球型蛋白分子量决定的 名义分子量为 10,000 道尔顿的过滤器的有效率为 90%-95%。 名义分子量为 100,000 道尔顿的的过滤器的有效率低一些。 适用于低分子量的药品和原材料： 抗生素 碳水化合物赋形剂 如果用于浓缩化合物-它们还会浓缩内毒素 静电吸引 使用带净正电荷的滤膜： 典型的额定孔径为 0.22 μm 或更小 尼龙 (聚酰胺膜) 电荷改良的 Z 电位膜 对 pH 9 的溶液有效 对含二价阳离子的溶液无效。 亲和色谱法 对合成的生物制品和药品有效 常用的介质包括: DEAE 琼脂糖 多粘素 B 琼脂糖 组胺琼脂糖 多粘素 B: 阳离子抗生素 捆绑并中和 LPS 内毒素灭活方法 酸/碱水解 氧化 干热 酸水解 可有效: 将 KDO 从类脂 A 中分离出来 游离的类脂 A 不可溶于水性体系中 碱解 非常有效。 类脂 A 发生化学变化: 脂肪酸的皂化 酰胺连接的脂肪酸的水解 效率的高低的决定因素包括: 碱的浓度 添加到处理过程中的能量 氧 化