色谱分析法 陈兢 .ppt

色谱分析法 陈兢 3011901005 1、高效液相色谱法（HPLC） 具有在分析过程中不破坏样品的特点，适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生化药物的分析。此外，对于某些极性化合物，如有机酸、有机碱等使用液相分析亦为方便。 HPLC法的种类很多，应用广泛。 （1）反相高效液相色谱法（RP-HPLC）： 以C8C18烷基硅烷键合相为柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈与缓冲液组成的溶液为流动相，以紫外监测器、荧光检测器或电化学监测器为检测手段，这种色谱体系在肽类、氨基酸、蛋白质和多糖等定量分析中应用广泛。 示例 生白能的RP-HPLC法测定 活性成分为重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，一种蛋白质。 磷酸缓冲溶液：Na2HPO43.55g加水400ml，溶解后用稀磷酸调pH到7.0加水至500ml，摇匀。 色谱条件、计算 (见书P331) 讨论：tR21.236min峰为生白能的主成分，tR13.639min峰为人血白蛋白（生白能添加剂）主成分与添加剂的分离度R2.0。采用梯度洗脱，，流动相中加入三氟乙酸，增大了对蛋白质的洗脱力，且使主成分锋形尖锐、对称。 （2）高效离子交换色谱法（HPIEC）： 是蛋白质、多肽分离分析常见的方法，具有以下特点： 1）根据相应的离子化程度对蛋白质、多肽进行分离。 2）梯度洗脱法是以盐浓度增大而进行的分离过程。 3）柱效中等并具有较高质量的活性回收。 （3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）： HPGFC柱上填充着微粒状的具有亲水性表面组成的有机物载体，或表面性质得到改造的硅胶类物质，可用于多肽和蛋白质等的分离及其分子量测定。 示例 HPGFC法测定重组人肿瘤坏死因子衍生物 的分子量 标准蛋白分子量曲线的制备：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶和抑蛋白酶肽制成混合标样，加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测得完全进入填料空隙的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系数对分子量作图13-4 样品测定：根据样品的保留时间求出其分配系数，由分配系数从标准蛋白分子量曲线上查出相应的分子量对数。 2、灌注色谱法 （1）基本理论： 传统的液相色谱法：流动相流经介质颗粒间隙，介质颗粒内部接扩散作用进行，需在低流速下进行，以维持一定的容量和分辨率，因而分离时间长；流速增大时，介质颗粒间隙被缩短，系统压力上升，介质内扩散难以有效进行，导致分辨率和容量的急速下降而不能得到满意的分离效果。 灌注色谱法：其介质为在聚苯二乙烯苯高度交联的基础结构上构成的贯穿孔颗粒分离介质（POROS）。其为双模式孔结构。 样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作用不再是主要的了。且由于颗粒内部表面积大幅度增加，容量和分辨率也随之提高。因此在高流速下，由于流动相流通路大幅度增加，故压力稍有上升，从而打破了传统的流速与柱容量、分辨率三者间的关系，使生物活性大分子如生化药物和基因工程药物的快速分离纯化和快速分析成为可能。 （2）应用： 蛋白质类、肽类和多聚核苷酸类等基因工程药物，如促红细胞省长苏、干扰素、白介素、集落刺激因子、组织型纤溶酶原激活剂、单克隆抗体等；酶类如溶菌酶、核糖核酸酶、超氧化物歧化酶等；天然药物成分如多糖类、低聚糖等；合成肽和其他生化药物如细胞色素、前列腺素等，应用灌注色谱法进行分离纯化和分析结果均满意。 3、高效毛细管电泳法 HPCE ：在多肽分离方面具有高效、快速等优点。 原理：根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小，即荷质比不同产生不同的迁移速度而进行分离。 毛细管电泳技术提供了与HPLC法完全不同的选择性，用HPLC法分离的肽图只有2~3个峰，而用HPCE法可分离出六个峰，分辨率高，同时在自动化程度、样品的用量、试剂的消耗及分析周期短等方面具有独特之处。 * *