睡美人转座系统在萨能奶山羊成纤维细胞中的应用.pdfVIP

·扬州· 第十六次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 ·251· 睡美人转座系统在萨能奶山羊成纤维细胞中的应用 张宏晓，姜保春，秦岭，萧鹏，刘红林 (南京农业大学，江苏南京210095) 引育 睡美人(Sleepingbeauty，SB)由编码转座酶基因的质粒和具有反向重复序列的转座子组成，它可以携带目的基 因进入多个物种和细胞系中。与其他转座系统的转座效率相比，SB系统在脊椎动物中的转座效率最高，它不仅能 在体外培养的人类细胞和小鼠细胞等大多数脊椎动物的细胞中发生转座，还可以在动物体内介导外源基因的稳定 整合和长期表达。萨能奶山羊具有很高的产奶性能，其中乳蛋白所占的比例较高，是作为生物反应器的主要候选品 种之一。本研究利用SB转座系统转染萨能奶山羊成纤维细胞，对SB系统在细胞中的表达进行分析。为转基因萨能 奶山羊的研究打下良好的基础。 材料与方法 I(3’一末端)酶切位点的引物(上游引物：5’一 根据pEGFP-C1质粒序列，设计含有蜊II(5’一末端)和Sp|Il GFP—IR正s—PuRo和pCMV-SB-Ultra按最佳比例再次转染细胞。分析其转染效率。 结果 I和8amH 电泳结果显示，得到目的条带为6021bp左右，用／Vhe 1I对所构建的载体进行酶切鉴定，分别得到了 4442bp左右和1 与传统的一次转染相比，两次转染法转染细胞的效率较高。对转染成功的成纤维细胞进行核型分析的结果显示，其 核型与正常的成纤维细胞相比，没有发生明显的改变。 讨论与结论 基因在成纤维细胞中整合效率最高，这说明转座酶含量过高或过低都不利于转座的顺利进行。在两次转染方法中， 第二次转染与第一次转染有长达42h的间隔，这段时间间隔使得转座酶基因有足够的时间来表达成熟的转座酶， 从而给转座子在具有适量丰富转座酶的细胞中进行转座提供了更多的机会。与传统的方法相比，两次转染的方法 显著的提高了外源基因在基因组中的整合效率．并且两次转染法转染细胞没有引起细胞染色体数目的改变，但是 关于转染的最佳间隔时间和低毒的转染试剂等转染条件，还衙要进一步的研究来确定。 关键词：睡美人系统；成纤维细胞；萨能奶山羊；EGFP 致谢：感谢国家转基因生物新品种培育重大专项对本研究的支持。