肾癌G250单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用.pdf

肾癌G250单克隆抗体的制备，鉴定及其初步应用 肾癌G250单克隆抗体的制备、鉴定 及其初步应用 专业：免疫学 硕士生：徐秀章 导师： 曹开源副教授 摘 要 【背景】 肾癌(RCC)是最常见的肾实质恶性肿瘤，其发病隐袭，死亡率商，早期诊 断非常困难。目前肾癌的治疗仍以手术为主，放、化疗效果不佳。临床上急需一 种能早期诊断和治疗肾癌的方法。近年来，在对肾癌TAA的研究中，发现肾癌 G250抗原具有良好肿瘤特异性，是较理想的肿瘤标记物和肾癌诊断治疗的靶点。 量试验证实核素标记的G250mAb和cG250具有良好的诊断及治疗的应用潜力，目 前已进入临床IⅡ期实验。向国内仍没有制备出肾癌G250单克隆抗体，严重制约了 国内有关肾癌生物靶向诊治研究的发展，因此，研制G250单克隆抗体使其国产化 显得急迫而重要。 由于单克隆抗体具有高度均一性、专一性和稳定性的特性，被广泛地应用于 诊断、治疗、预后等各个领域，极人地促进了生命科学的发展。在多种免疫方法 中，I)NA免疫弥补了传统的蛋白质免疫方法的缺点，并能有效激发机体的体液免疫 和细胞免疫。对于已知DNA编码序列而又不能获得纯化的目的蛋白或获得的抗原 蛋白为低免疫原性抗原，可采用DNA免疫的方法来获得相应的特异性抗体。DNA 免疫省时省力，为抗体的制备提供了一种新的免疫技术。其前景十分诱人。 【目的】 肾蟠5G250印克降执体的制各、鉴定旋其初步廊用 本研究旨在用DNA免疫的方法来制各肾癌G250单克隆抗体，并试图建立该 单抗的免疫组化方法，为今后肾癌的免疫学诊断及研究提供了手段，也为人源化 抗体研制用于肾癌的放射性显影诊断和生物导向治疗奠定了物质基础。 【方法】 大量提取并纯化pcDNA3．0．G250重组质粒，以其作为免疫原来免疫BALB／c 小鼠，用IIFA法检测免疫小鼠血清的效价。采用PEG法，将免疫过的小鼠脾细 胞与来自同系小鼠的骨髓瘤细胞(SP2／0)进行融合。在HAT选择培养蓬筛选下， 克隆生长孔用免疫荧光间接法检测上清抗体的效价筛选出阳件克降，并采用有限 稀释法进行克隆化培养。将杂交瘤细胞注入经降植烷预处理的BALB／c小鼠腹腔 制备腹水型单抗或收集杂交瘤细胞的培养液上清，并对获得的单抗进行鉴定分析， 包括单抗分泌稳定性的鉴定、单抗类别及亚犁鉴定、特异性鉴定、抗体效价测定、 细胞核型分析、耐冻融性测定、热稳定性测定以及用Westernblot法裕定与G250 蛋白的结合。利用制备的G250mAb进行免疫组化研究，初步探讨G250在肾肿瘤 组织，正常肾组织以及其它肿瘤组织巾的表达差异。 【结果】 获得两株抗G250单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1C4和1C10，两株 单抗均为lgM类。对该单抗进行特异性榆测，杂交瘤细胞培养上清及腹水型单 细胞以及T24细胞发生反应，而小与LNCap细胞、SP2／0细胞、BIU-87细胞、 培养上清及腹水效价分别为i：128和1；1024；两株杂交瘤细胞染色体数为100 析，在58KD处能够与G250蛋白特异性结合，与文献报道的G250的分子量大小 相符。 经免疫组化研究发现：G250在肾癌组织和正常肾组织的表达存在明显差异， 并且G250在不同的肾癌组织学类型中的表达也存在明显差异．其中透明细胞癌 表达最高。G250在肾癌组织的阳性表达与病例的临床分期呈负相关。虽然G250 11 肾癌G250单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用 的表达与病理分级无统计学意义，但从实验所得的数据上看，当病理分级升高时， G250的表达也呈现下降的趋势。对G250在其它肿瘤表达的探索研究中，发现 G250在其它肿瘤组织中也有广泛地表达。 【结论】 成功制备了两株抗G250的单抗，为肾癌的免疫学诊断和人源化改造提供了物 质基础。 2．应用免疫组化方法，进一步证实了G250在肾癌组织(尤其是透明细胞癌)表 达的特异性，明确了G250表达水平与肾癌临床及病理学参数之间的关系，为 今后G2