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Exosomes 对人舌鳞癌 Tca-8113 细胞杀伤的研究 王东关，王霞，孙善珍，姜广水 山东大学口腔医学院病理研究室(250012) sshzh@ 摘 要： 目的 检测人舌鳞癌 Tca-8113 细胞来源的 exosomes，体外刺激细胞毒性 T 淋巴细 胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL ）特异性杀伤癌细胞的能力。方法 分离纯化舌鳞癌 Tca-8113 细胞培养上清液中的 exosomes，并负载到从血液分离和培养的树突状细胞上，测 定其诱导的 CTL 对 Tca-8113 的杀伤活性。结果 exosomes 冲击致敏的 DC 能显著刺激 T 淋 巴细胞增殖，其诱导的 CTL 对细胞系 Tca-8113 具有显著的杀伤作用，在效靶比为 20:1 时 12ｈ为 43.60±5.66%,与 IL-2 培养的 T 细胞杀伤力相比差异有显著性，P0.01。结论 肿 瘤细胞培养上清液中分离出的 exosomes，负载到DC 上后，可以活化 T 细胞，使之成为抗原 特异性的 CTL，并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能，为口腔癌的免疫治疗开拓了新的途径。 关键词：Exosomes；Tca-8113；细胞毒性 T 淋巴细胞；树突状细胞 1. 引 言 [1] Exosomes 是由多种类型细胞所分泌释放的单层膜包裹微小囊泡。来源于肿瘤细胞 exosomes含有丰富的肿瘤排斥抗原，具有很多抗原表位；并富含MHC I类分子及与抗原递呈 [2] [3] 有关的HSP，具有更强的免疫原性 。在小鼠及人的多种肿瘤如乳腺癌、间皮瘤 、结肠癌、 [4] [5] 白血病、浆细胞瘤 、胃癌 的研究中，肿瘤细胞exosomes作为疫苗在试验性治疗中都取得 了显著疗效，但还无应用于口腔癌免疫治疗研究的报道。本研究拟从健康人外周血中分离单 核细胞在体外经 GM-CSF 及 IL-4 培养分化为 DC，经肿瘤细胞系 Tca-8113 培养上清液中分离 纯化 exosomes，体外冲击致敏 DC 并诱导 T 淋巴细胞产生 CTL，检测 CTL 在体外对肿瘤细胞 系 Tca-8113 的杀伤作用，以此评估 exosomes 作为口腔癌疫苗的前景。 2. 材料与方法 2.1 主要试剂、仪器与细胞 RPMI1640(GIBCO)；重组人白介素 2 rhIL-2(山东泉港药业有限公司)；重组人白介素 4 rhIL-4，重组人粒单细胞集落刺激因子 rhGM-CSF (PeproTech EC)；胎牛血清（杭州四季青 生物工程材料有限公司）；MTT （Sigma）；Tca-8113 人舌鳞癌细胞系 （中科院上海细胞库）； 健康志愿者静脉血 50ml；浓缩离心管 （Millipore）；低温高速离心机 （Biofuge Stratos）； 本课题受中国教育部博士点基金资助（20030422041） - 1 - 2.2 方法 2.2.1 Exosomes 的提取与纯化 收集Tca-8113 细胞培养上清液，0.45μm 滤膜过滤除去细胞碎片，转到滤膜孔径为 10nm 的Millipore 浓缩离心管的样品杯中，7500g×30min, PBS 洗两次，－80℃冻存备用，使用 前用 0.2μm 滤膜过滤除菌。 2.2.2 人血液 DC 的体外诱导扩增 采集健康志愿者的静脉血液 50ml，肝素防凝，加淋巴细胞分离液， 2000rpm ×20min 离心，收集单个核细胞层，RPMI1640 液洗涤去除血小板。20%胎牛血清、rhGM-CSF (1000u/ml)、 rhIL-4(800u/ml)的RPMI1640 完全培养基中培养 7 天。将DC随机分为实验组和对照组：实验 组加入Tca-8113 细胞exosome