Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达.pdfVIP

中　国　生 　物 　工 　程 　杂 　志 第 24 卷第 7 期 CHINA BIOTECHNOLOGY 2004 年 7 月 Magainin 和 cecAmil 抗菌肽基因的密码子优化 及在毕赤酵母中的高效表达 1 1 ,2 1 1 1 张素芳 　贾 　　 　蔡梅红 　仇妍虹 　陈溥言 ( 1 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 　南京 　210095 2 沈阳农业大学动物医学院　沈阳　110161) 摘要 　选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin 基因和 cecA mil 杂合肽基因全长分别为 101bp 和 60bp ,并在其 N 端引入 kex2 裂解位点 , 以保证表达抗菌肽具 有天然N 端 。其中 ,cecAmil 杂合肽基因根据 cecropinA N 端第 1～7 个氨基酸残基 、melittin N 端 α 第 5～12 个氨基酸残基所设计合成 。基因分别克隆入 pPICZ A 质粒 ,构建分泌型重组酵母表达 α α ( ) 载体 pPICZ Amag 和pPICZ ACM 。在 AOX1 醇氧化酶 启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的 magainin 及 cecAmil 蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 105mgL 和 118mgL 。初步抑菌活性测 定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及 E . coli DH5α有较好的抑杀活性 。 关键词 　抗菌肽 　基因改造 　SOE 　毕赤酵母 　分泌表达 ( ) 　　抗菌肽 antibacterial peptides , ABP 是生物体 适合在原核系统中直接表达 ,一般选用融合表达或 产生的一种阳离子小肽 ,具有广谱抗菌活性[1 ,2 ] ,其 真核表达 。在此 ,我们选用 Pichia pastoris 系统并成 作为广谱抗菌药物所具有的应用开发前景十分可 功表达了抗菌肽 magainin 和杂合抗菌肽 cecAmil 。 观 。相反 ,传统的从天然资源中提取的抗菌肽成本 1 　材料与方法 高 、得率低 、工序繁琐 ;合成肽则价格相当昂贵 ,也 难以应用于临床 。由于抗菌肽基因一般都比较小 , 11 　主要材料 故可以采用人工合成的方法来获得 目的基因 ,再进 E . coli DH5α为本实验室保存 ; Pichia pastoris 行基因工程生产 。美国马盖宁公司通过基因工程 ( - + ) α 受体菌 X33 His Mut 、表达载体 pPICZ A 购 自 生产的magainin 类似物 MSI78 ,上世纪末就已进入 ( ) Invitrogen 公司 ,指示菌金黄色葡萄球菌 Cowan Ⅰ Ⅲ期临床实验阶段[3 ] 。 由河南农业大学王川庆教授惠赠 。T4 DNA ligase 、 我们根据 magainin 、cec