PCR扩增DNA片段及产物检测的方法20111123.docVIP

聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的 1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。 2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。 3．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。??? PCR反应系统的组成引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。 三、试剂与器材 1、试剂10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) dNTP Mixture (各2.5 mM) TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl模板DNA (已预先稀释)上、下游引物混合物（已预先稀释） 2、器材 微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。 四、操作方法 1．编辑设定PCR扩增程序。 2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。 3．运行程序进行扩增。 4．电泳检测扩增结果。 五、关键步骤与注意事项 1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。 4．每次反应都要设置阴性和阳性对照。5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。 六、思考题 1、PCR进行的的基本条件是什么？2、PCR每一循环有哪几个步骤组成？ 3、影响PCR扩增的因素有哪些？4、优化那些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？ PCR扩增产物检测分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。 1．琼脂糖凝胶电泳 这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。 用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。 （1）制胶 琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml?0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。 （2）加样和电泳上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。 （3）检测将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。 它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：分辨率很强，可达1bp；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA；回收的DNA纯度高；其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍；避免了EB迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。 ?