一种优化的PCR方法———降落PCR扩增目的基因.pdfVIP

江苏临床医学杂志 2002 年第 6 卷第 2 期 　·127 ·　 ●技术与方法 一种优化的 PCR 方法 ——— 降落 PCR 扩增目的基因 1 2 1 3 1 1 万 　兵 　闫 　杰 　季明春 　张利宁 　申厚凤 　陈志琳 ( 1 ,扬州大学医学院 ,扬州 ,225001 ; 　2 ,北京地坛医院 ,北京 ,100011) (3 , 山东大学医学院 ,济南 ,250012) 　　摘　要　目的 :尝试用一种新的 PCR 方法———降落 PCR 扩增目的基因。方法 :在构建人 CD137 - hIgG1Fc - pCDNA3 融 合蛋白真核表达载体以及在检测 HBV 多聚酶 YMDD 变异的过程中运用降落 PCR 扩增目的基因。结果 :扩增出的特异性条带 与目的基因大小一致。结论 : 降落 PCR 省却了常规 PCR 中摸索最适退火温度的过程,对一些 Tm 值相近的 PCR 反应可应用一 套温度程序扩增 ,是一种行之有效的 PCR 方法。 　　关键词　优化 ; 降落 PCR ;退火温度 ( ) 　　中图分类号 :R446 61 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :1007 - 6514 2002 02 - 0127 - 03 ( ) 　　多聚酶链式反应 PCR 是在模板 DNA 、引物 第二军医大学曹雪涛教授惠赠 ; HBV DNA ,从 6 和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖 DNA 位慢性 HBV 感染者血清中抽提获得。试剂 : PCR 聚合酶的酶促反应[1 ] 。在实验室日常工作中经 试剂盒购自上海生工生物工程公司。引物 :扩增 常出现两种情况 :一种是因未找到最佳扩增条件 人 CD137 胞膜外区的引物 P1 :5 ’CCC AA G CTT 导致产生大量非特异性产物 ,另一种情况是未扩 A TG GGA AAC A GC TGT TAC 3 ’, P2 :5 ’AAA 增出任何产物。影响 PCR 的因素很多 , 除了受 CTG CA G CTG CGG A GA GTG TCC TG 3 ’;扩 PCR 仪器性能的制约外 ,也取决于反应体系和反 增 hIg G1Fc 的引物 P3 : 5 ’AAA CTG CA G TCT 应条件的设置 ,其中 Mg2 + 浓度、缓冲液 p H 值、循 TGT GAC AAA ACT CAC 3 ’, P4 : 5 ’CCC GAA 环条件等因素尤为重要 ,而循环条件中的退火温 TTC TCA TTT ACC CGG A GA CA G 3 ’, 扩增 度又是至关重要的因素。降落 PCR 是一种设计 HBV DNA 多聚酶的第一轮引物 P5 :5 ’TTC CCC 多循环以使相连循环的退火温度越来越低[2 ] ,从 CAC TGT CTG GCT TTC A GT CA T 3 ’, P6 :5 ’ 而达到最佳扩增条件的方法。我们在构建人 A TA CCC AAA GAC AAA A GA AAA 3 ’,第二轮 CD137 - hIg G1Fc - pCDNA3 融合蛋白真核表达 引物 P7 :5 ’TTC CCC CA