基因在大肠杆菌酵母中的高效表达.docVIP

【教学时数】4小时 【教学目录与学时分配】 4.1 基因的表达系统与表达策略(0.5) 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达(2) 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性 4.3 基因在酵母中的高效表达(1.5) 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 【教学目的】 让学生掌握基因表达系统的概念，基因在大肠杆菌与酵母中的高效表达策略，基因高效表达的实例。 【教学重点】 基因在大肠杆菌高效表达的策略和方式。 【教学难点】 基因在酵母中的高效表达。 【教学方式】 多媒体讲解结合启发讨论式教学 【教学过程与内容】 第一节 基因的表达系统与表达策略（0.5） 一、 基因的表达系统 基因的表达即有目的的合成目的基因的产物。包括转录、翻译、加工等过程。 表达载体：将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产。 表达载体的三个系统: 1 DNA复制及质粒DNA的筛选: 有多克隆位点，有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因 2 目的基因的转录的调控序列:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等. 3 蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子. （一）大肠杆菌表达系统 一个好的大肠杆菌表达系统应该满足的条件： ①尽可能低的诱导前泄漏表达； ②快速简便的诱导方式； ③能够高表达多种基因； ④易于进行克隆操作； ⑤能直接进行点突变和DNA序列分析而不要亚克隆，从而满足蛋白质工程研究的需要。 优点：操作简便，产量高，成本低。 缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 （二）酵母表达系统 优点：易培养，繁殖快，便于基因操作 缺点：缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌效率低，尤其是对于分子质量大于30KD的目的蛋白分子几乎不分泌。不适于高密度培养。 甲醇酵母表达系统：具有翻译后加工的功能，有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统。还能分泌目的基因产物导培养液中，有利于纯化等。 二、 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 1. 用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持蛋白质原有的功能 2. 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策略。 3. 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质。 第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达（2） 一、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍； 2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录； 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性； 4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的25％以上。 载体：pET表达系统pET15，pET16，pET28，pET30，pET42等a/b/c三套，及pRSET. pET28a 主要构件：T7噬菌体启动子，乳糖操纵子，核糖体结合位点，His标签序列，凝血酶切割位点，多克隆位点，T7噬菌体终止子及乳糖阻遏子序列lacI，pBR322复制子，fl噬菌体复制子，卡那霉素筛选标记序列等。 大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG（异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合成。 二、 蛋白质的融合表达 融合表达一般是将克隆化的基因引入某表达载体编码的高表达蛋白一起融合表达。高表达蛋白可以是担体蛋白，或任意在大肠杆菌总高效表达的基因具有良好的表达所需信号，融合蛋白的N端往往是担体序列编码的片段。 融合蛋白表达策略：①将融和蛋白以不溶性的聚集物形式表达，②采用缺失抑制蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，③试用不同的野生型菌株。 以融合形式表达目的蛋白的优缺点： 1）目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳 2）目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白 3）目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件 4）目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性 5）目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段