抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的基因克隆、表达及三维结构模建.pdfVIP

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的基因克隆、 表达及其三维结构模建 唐勇甄束苏 (中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所北京10蚴) Ⅳ型胶原酶又称作明胶酶，属于基质金属蛋白酶(~皿l心s)家族，其水解底物包括Ⅳ型、 kDa v型、Ⅶ型胶原等细胞外基质蛋白。根据其相对分子质量分为72ma(M^日P_2)和92 (^n伊-9)两种形式。Ⅳ型胶原是构成基底膜的关键组分，在基底膜中起支架作用。Ⅳ型 胶原酶降解Ⅳ型胶原，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，引起肿瘤细胞的侵袭与转 移…。肿瘤细胞的侵袭力与其Ⅳ型胶原酶的活性密切相关[2]。另外，新生血管内皮细胞 也具有很高的Ⅳ型胶原酶活性；抑制Ⅳ型胶原酶等n皿伊s活性可以抑制肿瘤侵袭转移与 抑制血管生成【3J。我们实验室研制了一株特异性抗Ⅳ型胶原酶的小鼠杂交瘤细胞株 3D6，并以单抗3D6作为载体进行靶向性治疗研究获得了较好的实验疗效。但是完整抗 体具有相对分子质量大，穿透力低，应用于人体时易产生人抗鼠抗体反应[4]。为了克服 这些缺点，我们采用噬菌体呈现技术构建了抗Ⅳ型胶原酶单抗3D6的单链抗体(sd阳)基 因并在大肠杆菌中进行表达。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株、质粒及试剂 大肠杆菌TGl及质粒删TAB5E购自P}1aml8ch公司； DNA TaI(aR丑公司产品，1、aq polyrnerase购自上海生工公司；总RNA提取试剂盒购白博 大公司，mRNA纯化试剂盒购自№nega公司；抗Etag抗体购白Phamacia公司，m口 标记的羊抗鼠IgG抗体购自北京中山公司。 1．1．2Pclt引物 back，vLfor，link日引物及Rs引物购自Phar— vHback，vHfor，vL mada公司。 1．1．3细胞株 抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤细胞3D6由本室构建；高转移性人巨细胞肺癌 PG细胞由北京医科大学病理系吴秉全教授提供；NI}B1r3细胞来自北京市肿瘤研究所。 1．2方法 1．2．1基本分子生物学操作 质粒的提取、酶切、DNA片段的回收、连接、转化均参照 文献进行。 1．2．2单链抗体基因的构建 从抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤细胞中提取总RNA，纯化出 back、VHf。r和Vi for为引物反转录扩增 mRNA。以rrlRNA为模板，分别以V0 bacl【、Vi -381· ng，加人Iinker引物， 出VH和VL基因。经琼脂糖凝胶电泳分离回收后，取vH、vL各50 以94℃变性lrnin，63℃退火延伸4 lIIin，运行7个循环组成scFv基因。然后用RS引物进 行二次P(聚，条件为：94℃变性1m_m，55℃退火2 rnin，72℃延伸2TIlin，30个循环。纯化 的8d～基因经SfiI和N0t I酶切后克隆人质粒删删E中，构建噬菌体呈现质粒 pCANs毋v，转化大肠杆菌TGl。 1．2．3sc]n的噬菌体呈现及筛选随机挑取48个TGl重组子，接种于含100飕／Ⅱd 氨苄青霉素的LB培养液中培养过夜。第二天按10％比例分别转接至2×丫r．AG培养液 (含100旭／“氨苄青霉素、2％葡萄糖、5×10Bpfu／甜辅助噬菌体M13KOr7)，37℃振荡培 养2h后离心去上清，分别加入2×YT-AK培养液(含100艚／“氨苄青霉素、50博／Hd卡 那霉索)，于37℃培养过夜。离心取上清进行间接ELISA测定。选取活性最高的一株阳 性克隆434进行后续研究。 1．2．4间接Ⅱ皿A用含1％Ⅳ型胶原酶的磷酸盐缓冲液包被酶标板，4℃过夜。用