细胞体外加力的实验方法.pptVIP

细胞体外加力的实验方法 研究目的 骨组织的主要功能结构支撑。 力学刺激下，骨的结构变化（骨生成和骨吸收），以适应相应的力学环境。 力学环境包括生物体外、体内细胞之间的相互作用力和细胞内张力等。——力学系统。 目的：更好地理解细胞的结构一功能关系及调节机制,必须结合力学观点加以研究。 研究现状 实验方法： 在体环境：异常复杂,各类细胞各有特点，细胞之间关系复杂。 离体环境：细胞生理或病理现象的研究仍依赖于体外分离、培养。 人体细胞尺度在十几至几十个微米之间, 细胞膜的厚度仅有几个纳米至几十个纳米。因此, 常规的宏观力学加载方法和实验技术无法直接使用。 细胞力学实验研究关键在于细胞的体外加载技术。在此基础上,通过显微、摄像及计算机图像处理系统,对细胞的生长及其形态变化进行观测与分析。 体外细胞力学加载方法 新近发展起来的方法包括:滴孔技术(pore)、探压技术(poring technique)、悬浮技术(suspending technique)、激光捕息法(laser trap)、双微滴管技术、流动小室(flow chamber)和细胞过滤时间分析仪(cell transit timeanalyzer),基底应变加载技术(substrate stretch loadingteehnies),细胞分子学加载技术(cell molecular loading technics)等。 大体分为三类： 模拟体内力学环境的加载方法 模拟体外力学环境的加载方法 研究单细胞力学特性的加载方法 ?模拟体内力学环境的加载方法 利用对细胞粘附的基底材料进行间接加载, 通过对基底材料加载后使基底材料的应变传递到细胞上, 如四点弯曲梁的单向应变加载和膜材料的双向应变加载方法、气体加压加载技术, 以及三维加载技术等. Petriperm 弹力膜培养皿 90 年代初问世。其原理就是通过弹性底面的形变, 使附着于该底面的细胞受到牵张力。实验通过调节弹性底面圆心的垂直形变量, 达到调节细胞受力的目的。另外附加一些机械装置, 可以调节力的周期。 优点：加力方式较为接近正畸临床牙齿受力状态,；避免空气液体传导静压力加力装置对实验周期的限制；可用于体外细胞培养的持续性、间歇性间歇性牵张力。 价格十分昂贵。 流体剪切应力加载装置 复杂流体剪切应力装置 ?模拟体外力学环境的加载方法 离心力加载装置 空气液体传导静压力加载装置 离心力加载装置 原理：经分离培养得到的离体细胞在离心力作用下受到离心力、重力、细胞与细胞基质间的摩擦力。 用于观察失重状态下细胞变化,对重力生理学和航天生物学具有独立的理论、实际意义。 缺点：细胞间、细胞与基质间无附着关系，从而影响细胞的功能状态，无法反映真实的细胞生理状态。 空气液体传导静压力加载装置 ?研究单细胞力学特性的加载方法 微管吸吮技术 发展：20世纪30年代,cole采用挤压的方法研究海胆卵的弹性构造；—— 照片上不能准确地确定接触面积; Norris细各一微形针置于红细胞中,测量针的弯曲变形确定作用力；——这一方法难以实现； 50年代中期,微管吸吮技术出现。 采用显微技术和微管吸吮方法直接对单个细胞进行加载, 通过实时记录系统记录, 利用图像处理仪和计算机进行位移测量及变形数值分析。 应用：检测单个细胞或细胞对变形和粘附的重要手段。 微管吸吮技术 组成：由微吸管、显微操作器、倒置显微镜、负压加载系统、磁带实时记录系统、图像处理仪、计算机等组成 优点：测量精细，易于标定；重复性好 缺点：检测对象为单个细胞；变形部分膜张力不均；技术方面的校正 技术遵循基本假定:细胞膜与玻璃管之间没有磨擦力(通常管的表面涂有一层蛋白质);动态条件下,培养液流体粘性力相对于细胞自身的粘性力是可以忽略的。 分子水平加载技术 原理：通过对细胞表面受体施加磁场扭曲力的方法,测量细胞骨架刚度的变化。 过程：微米级的永久性磁球,表面结合蛋白质分子使磁球与细胞膜受体结合;外加磁场磁化磁球,在垂直方向加一个均匀弱磁场使磁球旋转;此时如果受体与细胞骨架连接在一起,细胞骨架对磁球的旋转产生阻力。 测量：测量磁球产生的磁场力的变化,定量地获得细胞内的力学参数。外力矩和应力可以用标准粘性物质标定,磁球旋转的角度可以用磁力测量仪测定。 优点：施力恒定，受力均匀，磁力定量，方便定位；可以测量细胞受体分子水平的力学性质。 从外界力到功能 应力/应变影响细胞的形态,到达感应细胞的感受器； 获知到应力刺激后，细胞信号传导通路将机械信号转化为生物化学信号； 传导到达效应位点，调节相关分子的表达，最终影响细胞的功能活动。 展望 不同的实