宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点甲基化及其临床意义.pdfVIP

山东医药 2011年第51卷第6期 · 临床研究 · 宫颈癌 C一33A细胞 RASSF1A基 因启动子 CG位点甲基化及其临床意义 崔华英。周栩茹，韩 庆 。李晓兰 (宜昌市第二人 民医院，湖北宜昌443000) 摘要：目的 检测宫颈癌C-33A细胞 RASSF1A基因启动子CG位点甲基化状态及mRNA，并探讨其临床意义。 方法 提取正常健康人宫颈上皮细胞和宫颈癌 C-33A细胞总DNA和RNA，分别进行重亚硫酸氢盐测序(BSP)和 RT—PCR扩增，检测 RASSF1A基 因启动子 CG位点 甲基化状态和 RASSF1A基因 mRNA。结果 C-33A细胞 RASSF1A基因启动子 CG位点呈现高甲基化状态，显著高于正常官颈上皮细胞(P0．01)；C一33A细胞 RASSF1A mRNA表达量明显低于正常宫颈上皮组织(PO．01)。结论 宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点呈 高度甲基化状态，其RASSF1AmRNA表达明显受到抑制。RASSF1A基因启动子CG位点甲基化在官颈癌发生过程 中发挥重要作用。 关键词：宫颈肿瘤；宫颈癌；RAS相关域家族 lA基因；启动子；甲基化 中图分类号：R737。33 文献标志码：B 文章编号：1002-266x(2011)064)0344)2 RAS相关域家族 1A(RASSF1A)基因是从 3号 CpG岛的定义预测其 中586—1190bp为 CpG岛。 染色体短臂克隆出来的新型抑癌基因，其表达产物 用 MethylPrimerExpressv1．0针对 CpG岛设计 BSP 含有与RAS蛋 白结构相关区域，包含一个RAS结 引物，甲基化引物为：正向5-TFAG1rGGGTAGGTrA— 合区和一个ATM磷酸化位点 J。RASSF1A基因在 AGTGTGTrG-3 反 向 5 =CAACTCAATAAACT— 一 些癌细胞系中有很高的表达缺失，使用甲基化抑 CAAACTCCC-3,扩增产物长度为441bp，含有 34个 制剂可使RASSF1A基因重新表达，进而抑制细胞增 CG位点。 殖，阻止肿瘤形成。目前研究表明，在胃癌、结肠癌、 按照DNA提取试剂盒说明提取 C-33A宫颈癌 乳腺癌和肺癌等组织中RASSF1A基因启动子呈甲 细胞和正常宫颈上皮组织DNA，用重亚硫酸盐将未 基化状态，提示RASSF1A基因在肿瘤的发病机制中 甲基化C转化为U。BSP总反应体系为25 ，其中 扮演重要角色 J，但在宫颈癌发生中的作用尚不明 上下游引物为 1I*1，甲基化修饰后的DNA2txl。 BSP反应条件为：95℃预变性5rain，95oC变性30 确 。2009年 1月～2010年 1月，我们检测了宫颈 S，64oC退火 45s，72℃延伸 60s，循环 35个周期 癌 C-33A细胞和正常官颈上皮细胞 RASSF1A基因 后，最后 72℃延伸 10min结束，BSP后的产物采用 启动子 CG位点甲基化状态及 RASSF1AmRNA表 TA克隆的将其连接到pMD20-T质粒载体，转化至 达变化，探讨 RASSF1A基因启动子 CG位点甲基化 DH5a感受态细胞后挑选 10个阳性克隆测序，测序 在宫颈癌发生中作用。现报告如下。 结果采用BiQAnalyzer分析。 1 资料与方法