外源p21WAF1转染对人成纤维细胞凋亡的影响.pdfVIP

生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 ISSN 058229879 ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2000 , 32 ( 1) :35 - 38 CN 3121300/ Q 外源 p21WAF1 转染对人成纤维细胞凋亡的影响 黄 　英 　杨 　龙 　张宗玉 3 　童坦君 ( 北京医科大学生物化学与分子生物学系 , 北京 100083 ) 摘要 　　构建了有义和反义 p 21WAF1 逆转录病毒表达载体 , 分别经脂质体包裹后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS) 。Southern 印迹杂交证实转染细胞中外源 p 21WAF1 cDNA 已整合入基因组中。与空载体转染细胞相比, 有义 转染细胞的 p 21WAF1 mRNA 表达上升 ; 细胞增殖速度明显减慢 ; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性降低 , 表现在细胞存 活率升高 , 核 DNA 梯状断裂片段出现的时间滞后 , 断裂片段浓度下降 , 流式细胞计检测的凋亡峰面积缩小。而反 义转染细胞的 p 21WAF1 mRNA 表达下降 ; 细胞增殖速度较快 ; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性上升 , 有关表现与有义 转染细胞相反。说明 2BS 细胞内 p 21WAF1 的表达量与其被丁酸钠诱导凋亡的能力呈负相关。 关键词 　　p 21WAF1 ; 细胞凋亡 ; 基因转染 ; 丁酸钠 WAF1 ( ) 　　p 21 作为细胞周期的重要调控基因 , 与细 切酶、噻唑蓝 M TT 购自华美生物工程公司 ; 胞增殖、分化、衰老、DNA 的损伤修复等密切相关 , DMEM 高糖培养基、G418 、Lipofectin 试剂均为 它与细胞凋亡的关系也越来越多地引起人们的关 ( ) Gibco 公司产品 ; 丁酸钠 NaBu 购自日本 Osaka 公 注[1 ] , 但至今尚无定论。人衰老成纤维细胞中 32 α 司 ; [ 2 P ] dCTP 为亚辉生物医学工程公司产品 ; p 21WAF1 的表达比年轻细胞高 10～20 倍[2 ] , 其凋亡 ( ) 随机引物试剂盒 Prime2a2gene labeling system 为 的可诱导性却大为下降[3 ] , 两者是否相关 ? 尚未见 Promega 公司产品。 国内外有关报道。我室曾成功地用丁酸钠诱导了正 1 . 2 　方法 常人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡 , 并发现凋亡过程 1. 2. 1 　质粒的抽提、酶切及 DNA 片段的回收、连 WAF1 WAF1 中 p 21 的转录活性降低 , 为探明 p 21 在人 接、转化 　　参照 Sambrook 等[5 ] 的方法进行。 成纤维细胞凋亡中的作用 , 我们进行了以下研究。 1. 2. 2 　2BS 细胞转染 　　细胞接种于含 10 %胎牛 血清的 DMEM 培养基中 , 5 % CO2