长白山白眉蝮蛇蛇毒酶基质辅助激光解吸质谱分析.pdfVIP

第27卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报 第 3期 1995》年 3月 Chinese3oumalofAnalyticalChemistry 297~299 长白山白眉蝮蛇蛇毒酶的基质辅助激光解吸质谱分析 孙明忠 季怡萍 丁 兰 赵大庆’ 倪嘉攒 (中国科学院长春应用化学研究所稀土化学与物理开放实验室，长春 130022) 摘 要 用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法对长白山眉蝮蛇蛇毒所含4 种主要酶:磷脂酶A、精氨酸醋酶、纤溶酶及吞氨基酸氧化酶进行了纯度鉴定和分子量测定， 结果表明MAI.DI-TO-FMS具有灵敏度高、分辨能力强、分析时间短及样品用量少等优点。用 MALDI-TOFMS法分析蛇毒酶的纯度和分子量简捷、快速且重现性好，是SD-S聚丙烯酞胺凝胶 电泳所无法比拟的。 关键词 基质辅助，激光解吸质谱，白眉蝮蛇，酶 1 引 言 蛇毒是自然界中最丰富、最集中的酶源之一，其组成蛋白质半数以上是具有各种催化活性 的酶类，迄今为止人们已从蛇毒中发现了近40种酶’〕〔。采用常压层析的方式，从长白山眉蝮 蛇毒中纯化得到4种酶。磷脂酶人(PLAZ)、精氨酸醋酶(AEase)、纤溶酶(fibrolase),SDS 电泳鉴定为单一蛋白，质谱结果与电泳结果一致，L-氨基酸氧化酶(L-a.a.oxidase)质谱结果表 明该酶由两个不相等亚基组成。 自Karas和Hillonkamp(2)及Tanaka(3〕等将基质辅助技术引人TOFMS以来，MALDI-TOF-MS 法由于特有的高灵敏性、测量质量范围宽(300kDa户〕等优点，已越来越广泛被用来分析生物 大分子4(,5)，用该法对蛇毒组分的研究较多6-〔8)，但蛇毒酶类提纯困难，因此对单一组分的分析 报道较少。 Z 实验部分 2.1样品制备 PLAZ:粗毒经DEAE-SephadexA-50(A-50),SephadexG75(G-75)柱(3次)四步层析得到; Fibrolase经A-50,G-75和A-50得到;AEase经A-50,G75,A-50,G-75四步得到;L-a.a.oxidase经 A-50,G75(2次)，A-50(1一2次)得到。 2.2 仪器与实验条件 LDI-1700激光解吸电离飞行时间质谱仪(LinearScientific,USA),NZ激光波长337nm，脉 冲宽度3ns，真空度1.3x10-3Pa，加速电压30kV，吸引电压9.3kV，检测器电压一4.75kV，质 谱信号单次扫描累加50次，正离子谱测定。HP-G2503A蛋白标样质量校正误差为10.05%Q 2.3 实验方法 二次水配制浓度0.50彭L的酶液，取10匹酶液置于样品杯中，加人等体积芥子酸(基质) 混匀。再吸取2f.L此溶液，滴于样品探头靶心上，抽空除去溶剂，结晶后快速送入离子源进行 检测，质量范围m/z0一100kDao 1998-05一 收稿:;1998-09-07接受。 本文系吉林省科委资助项目。 298 分析 化学 第27卷 3 结果与讨论 3.1PLAZ的MALDI-TOFMS PLA2的MALDI-TOFMS见图1，由SDS测得PLA2分子量约为13.8kDa可知，m/z 14008.0质谱峰为PLA2质子化分子离子峰即仁M+H]峰‘，m/z6995.3和m/z28127.3峰分别 为PLA2双电子荷峰仁M+2H]2和‘二聚体峰仁2M+H]+，双电荷峰和多聚体峰出现是对分子离 子峰进一步确证。同时还出现了2〔M+2H]，十花3M+2H]2+,仁3M+H]干、[4M+H]+,仁5M+ H]等‘一系列相关的多聚体峰。 3.2 FIbrolase的MALDI-TOF-MS 图2为fibrolase的MALDI-TOF-MS，其中m/z23523.6质谱峰为fibrlase的M〔+H]+峰， m/z11751.9和m/z47125.1分别为fibrolase双电荷峰及二聚体峰，还测到该酶一系列多聚体 的存在。