绿豆降血压肽的分离纯化(刘祎炜).docVIP

绿豆降血压肽的分离纯化 08食品科学与工程1班 刘祎炜 由蛋白经蛋白酶等酶分解后，除去未反应的蛋白质，然后。降血压肽（antihypertensive peptide，AHP）是一类能够降低人体血压的小分子多肽。它生理功能抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，从而达到降低血压的作用。其作用是阻断血管紧张素向血管紧张素转化，从而阻断血压上升降血压肽来源于天然动、植物及微生物，具有降血压效果明显、无毒副作用等优点。在许多植物蛋白中，存在着一些特殊的短肽（C3～C12），经蛋白质分解酶的作用而产生，它们都具有一定的抑制血管紧张素转化酶的活性，从而抑制高血压的发生。这种作用仅发生在血压偏高的动物身上，对血压正常者无效，也无副作用。ACE的抑制效果，最终得到中性蛋白酶水解产物对ACE的抑制效果最强，在pH值为8．0，温度为45℃，酶与底物浓度比6％，水解时间480min时，水解度达到52％，得到的ACE抑制肽活性最强。用胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶分别对绿豆分离蛋白进行酶解，并分析水解度的高低、分子量的大小与降压效果的关系。结果表明，碱性蛋白酶的最大水解度可达到21％，依次为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，最低为胰蛋白酶仅为9％左右，与此对应的碱性蛋白酶的酶解物的ACE活性抑制率为最高(44．9％)，胃蛋白酶次之(43．5％)；分子量范围在1000Da以下组分对ACE的抑制效果最高，碱性蛋白酶作用获得的小分子肽组成为71．25％，胃蛋白酶的为69．35％，但其对应的ACE抑制率却为64．57％和78．49％。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作用获得的小分子肽的ACE抑制率分别为45．7％、47．3％和29．6％。由此可见，水解度越高、分子量越低的绿豆肽降压效果越好。而单酶水解法存在水解度较低、低分子量肽得率低等缺点，而复合酶法可以克服单酶法的这些不足，除少数双酶酶解所得的绿豆降血压肽活性较高外，其他双酶法的作用效果与单酶法相比，并没有明显优势。这说明酶作用于底物的机制是一种非常复杂的现象。 在绿豆降血压肽制备的研究中，与直接酶解法不同，因微生物发酵机理较复杂，进程不易控制，目前较少应用。与直接酶解法生产绿豆多肽相比，发酵法利用豆粕作为发酵底物，使得原料成本低廉、工艺过程简便、条件温和，得率提高10％～20％，成本却仅为酶解法的50％~60％。 绿豆降血压肽的分离纯化 目前常用的分离纯化方法为：先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的绿豆蛋白质及色素等物质，然后用超滤除去不溶底物、分子量较大的绿豆蛋白质和肽类，获得所需要的降血压肽，再用凝胶过滤层析柱将混合物通过多孔的凝胶床而达到分离目的。由于许多肽结构很接近，根据具体情况可以再结合离子交换色谱，通过电荷的差异，达到更好的分离效果。 离子交换色谱是发展最早的层析技术之一, 它的原理是因溶质分子带不同性质的电荷和不同电荷量, 可在固定相和移动相之间发生可逆交换作用, 使溶质移动速度变化, 从而达分离目的。常用离子交换剂包括离子交换树脂、离子交换交联葡聚糖、离子交换纤维素和离子交换琼脂糖等。目前, 离子交换色谱已成为蛋白质分离纯化最常用的手段, 统计显示, 在蛋白质纯化方案中, 使用到离子交换层析的占75%, 其次是亲和层析和凝胶过滤层析。 SP - Sephadex C - 25 是用于分离低分子量的蛋白质、多肽和核酸等, 或是分子量极大的物质(分子量 200000Da) 。这主要是由于离子交换剂本身带有强的功能基团磺丙基( SP - ) , 且颗粒较细, 适合带电荷量不大且分子较小的物质的吸附, 又由于母体Sephadex具有分子筛效应, 使它在分离物质的同时, 具有离子交换作用和分子筛效应。选用SP - Sephadex C - 25 对乙醇浓度为75%时从大孔吸附树脂洗脱下来具有降血压作用的绿豆肽进行分离纯化。 绿豆降血压肽的纯度分析 RP-HPLC的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析。RP-HPLC的溶解能力较大且RP-HPLC柱效高、分离能力强、保留机理清楚，与其它色谱方法相比，具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势，对于肽和蛋白质的分离分析，RP-HPLC正受到越来越多的关注，非常适合于复杂体系中降血压肽的定量分析，也为其他小分子肽类物质的定量分析提供了有效的科学依据。由于RP-HPLC较高的分辨率及独特的选择性，作为一种蛋白质及多肽的分离分析手段已越来越得到人们的认可，并用于许多新兴领域如蛋白质组的分析。多种联用技术如RP-HPLC质谱、RP-HPLC毛细管电脉及RP-HPLC生物传感器的出现也使得更加快速的在线分析成为可能，实现了对样品各成分分子量、纯度及活性等的实时分析。试剂降血压肽标准品按LysVal Leu Pro