弓形虫微线体蛋白MIC3基因克隆及原核表达.pdfVIP

弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达 ， ， ， ， ， 1 2 3 2 1 2 1 2 2 1 2 江 涛 ，周艳琴 ，刘 琴 ，聂 浩 ，姚宝安 ，赵俊龙 ( 1 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 湖北 武汉 430070； 2 华中农业大学动物医学院 湖北 武汉 430070； 3 荆州职业技术学院 湖北 荆州 434100) 摘 要: 根据编码 MIC3 的已知基因序列设计并合成一对引物，应用 PCR 技术从弓形虫 RH 株的基因组 DNA 中扩增编码MIC3 的全长基因，克隆入 pGEX--KG 表达载体，转化入 E.coli DH 5α感受态细胞，经含氨苄青霉素琼脂平板筛选，小量抽提质粒进行酶切、PCR 及 DNA 测序 鉴定。然后阳性重组质粒转化入 E.coli BL21Codonplus，IPTG 诱导，表达产物经 SDS 和 Western-blot 分析鉴定。结果显示，扩增的 MIC3 基因与 GenBank 上相应基因序列的同源 性达 99.6 %，表达的 MIC3 融合蛋白表观分子量约为 66 KD，且可被兔抗弓形虫免疫血清识 别。说明所获得的表达蛋白质具有一定的免疫反应原性，为下一步利用重组蛋白建立弓形虫 的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定基础。 关键词: 龚地弓形虫；微线体蛋白 3；基因克隆；表达 龚地弓形虫 ( Toxoplasma gondii ) 属于专性细胞内寄生原虫，能引起严重的 人兽共患弓形虫病 ( Toxoplasmosis ) ，对免疫功能低下者及孕妇危害尤其严重， 常导致器官移植和AIDS病患者致死性损害，孕妇流产、畸胎、死胎，新生儿脑 炎、智力障碍等[1] 。动物弓形虫病的传播与流行常给畜牧业生产造成极大损失, 如猪羊弓形虫病常导致流产、弱胎、死胎，高热、消瘦，暴发性流行常导致动物 [2] [3] 大量死亡 ；患弓形虫病的宠物往往成为人类感染弓形虫病的重要传染源 。 弓形虫微线体蛋白MIC ( Microneme protein ) 是分布于虫体前端棒状体周 围的微线体所分泌的粘附因子，与虫体对宿主细胞的识别和结合有关，在虫体入 侵宿主细胞早期阶段发挥重要作用[4] 。MIC3 是其中非常重要的微线体蛋白，由 于MIC3 在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达，被认为是在弓形虫病 的诊断和疫苗研制上非常有前景的候选分子[5,6] ，但目前关于编码弓形虫全长 MIC3 基因的原核表达研究，国内外尚未见报道。由于大肠杆菌具有培养条件简 单、生长繁殖快、能高效表达外源蛋白质以及采用适当方法使表达的外源蛋白质 复性折叠后，可恢复其生物学活性等特点，而倍受人们重视。本研究旨在克隆编 码全长MIC3 的基因，然后进行原核表达，并对表达产物的免疫反应原性进行鉴 定。 1 材料与方法 基金项目：高等学校博士点科研基金项目（20040504016 ）及教育部重点科研项目资助 作者简介：江 涛(1964--)，男，湖北天门人，副教授，博士研究生，主要从事寄生虫分子生物学研究。 通讯作者：赵俊龙, email: zhaojunlong@ -1- 1.1 材料 1.1.1 龚地弓形虫 弓形虫 RH 株由本室从华中科技大学同济医学院引进并液氮 保种。 1.1.2 菌株与质粒 E.coli DH5 α、E.coli BL21Codonplus 及 pGEX-KG 表达载体 由本室保存。 1.1.3 实验动物 昆明株小鼠，体重 20~22