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第二章?细胞生物学技术 —、光学显微镜 （一）普通光学显微镜（略） （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 功用： 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；能显示细胞样品的立体结构；分辨力是普通光学显微镜的3倍；能扫描不同层次，形成立体图像。 （三）激光共聚焦扫描显微境 1、特点:高分辨率（0.18μm）、高灵敏度、高放大倍数 2、在生物医学中的应用（主要） （1） 细胞、组织的三维重建 （2）对活细胞进行无损伤的适时观察分析（各种细胞器、核酸、蛋白质等物质） （3） 细胞内钙离子、pH值和其他离子动态分析 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）微分干涉差显微镜 （DIC） 1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 （九）当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体； 自动化与电子化。 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍； 用于观察超微结构（小于0.2μm）。 （1）超薄切片 超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 （2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 （ 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜。 断面的三种处理方法： 蚀刻（ etching ）、不蚀刻（no etching ）、深度蚀刻（deep etching ） （二）扫描电子显微镜 主要用于观察样品（细胞）的表面形貌 （三）扫描隧道显微镜 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.01nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 三、显微操作技术 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 在保持细胞结构完整的条件下，通过化学反应对细胞内各种成分进行定性、定位和定量的研究，以及了解这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术。 原理：利用某些化学物质可与细胞内某种成分发生化学反应，而在局部范围内形成有色沉淀或电子密度高的物质。 可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合物等进行定性、定位、定量研究。 二、荧光细胞化学与免疫荧光 荧光细胞化学：自发或激发荧光 免疫荧光：利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 免疫荧光法：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 酶标免疫法：如辣根过氧化物酶。 三、放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。 四、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybridization）。 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 （二）Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核