2%2c4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC检测树莓中的游离氨基酸.pdfVIP

2，4．二硝基氟苯柱前衍生HPLC检测 树莓中游离氨基酸 赵英莲1，李艳1，+ 河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018 摘要：目的：建立一种简单、快速、可同时检测22种氨基酸的色谱方法，并利用此方法对树莓中的游离 氨基酸进行检测和分析，为树莓果的开发奠定基础。方法：以2,4．二硝基氟苯(DNTB)为柱前衍生试剂， HypersilODS2色谱柱，流动相A为乙酸钠，流动相B为50％乙腈水，梯度洗脱，反向高效液相色谱，二极 为1．19．4．97ug／mL。利用所建方法检测出树莓果中含有14种游离氨基酸，其中6种人体必需氨基酸，占总 氨基酸量的29．36％。结论：所建方法操作简便，重现性好，树莓果氨基酸含量丰富，有开发价值。 关键词：树莓；氨基酸；高相液相；2,4．二硝基氟苯 树莓属蔷薇科悬钩子属植物【l】，是一种酸浆属水果，富含丰富的氨基酸。氨基酸是蛋白 质的基本单位，也是生物合成酶的重要组成单位，对人体健康有重要作用。 目前，用于果蔬食品中氨基酸分析的方法有气相色谱法i2J、毛细管电泳法【3J、氨基酸分 析仪【4】和液相色谱法【5】。其中反向高效液相(RP。HPLC)结合柱前衍生检测氨基酸的方法备受 关注，原因是其运行时间短、设备简单，且成本相对较低。Fabiani等人【6】用RP．HPLC以氯 以2，4．二硝基氟苯为柱前衍生试剂检测了青果中16种氨基酸；高向阳等人【8J以6一氨基喹啉 ．N一羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)为衍生试剂检测了齿果酸模中17种氨基酸。然而在果 蔬类食品氨基酸含量检测中，尚未见可同时检测22种氨基酸的报道，因此，建立一种快速、 可靠、准确，并同时检测22种氨基酸的方法，用于检测分析树莓及同类型浆果的氨基酸含 量，可为其开发与利用提供科学依据。 1材料与方法 1．1材料与试剂 22种氨基酸标品均购白美国sigma公司；色谱级甲醇和乙腈购白湖北杜文化工科技有 限公司；2，4．二硝基氟苯购自艾科化学试剂公司；磷酸二氢钾、无水乙酸钠、冰乙酸、三 乙胺、硼砂、硼酸、氢氧化钠均为分析纯；实验用水为哇哈哈纯净水。 树莓由河北赞皇丸京果品有限公司提供。 1．2仪器与设备 Waters 2695高效液相色谱仪配有Waters2695分离单元，2996型二极管阵列检测器为沃 大连 特斯科技(上海)有限公司；色谱柱：HypersilODS2色谱柱250mm×4．6mm，I．D59m 依利特分析仪器有限公司。 1．3溶液的配制 氨基酸标品的制备：称取异亮氨酸25mg、酪氨酸10mg，其余20种氨基酸各50mg， 分别用pH9．0硼酸缓冲溶液溶解，定容至10mL。取异亮氨酸lmL，酪氨酸2．5mL，其余20 种氨基酸各0．5mL混合，用pH9．0硼酸定容到25mL，所得溶液为氨基酸混标，置于4。C冰 箱避光保存。 1．4方法 1．4．1衍生程序 衍生程序见参考文献【91。衍生后的产物过0．45pro的有机膜，取10／．tL进样。 1．4．2色谱条件 流动相A：40mM乙酸钠，流动相B：50％乙腈水。流速：lml／min；检测波长：360nm： 柱温：23C；进样量：10p．L；梯度洗脱，流动相B的洗脱程序如下：0．20min：30％一36％， 98％．30％。 1．5样品的制备 树莓是在2013年8月采摘于河北省石家庄市赞皇县山区，采摘后将其分装并储存在．20。C 冰箱中。检测时将其解冻，破碎，过滤，4500rpm离心15min，分离上清液置于干净的试管 中用pH9．0硼酸碱化，得到pH8．2的样品，待测。 2结果与分析 2．1衍生试剂选择 因大多数氨基酸不含芳香环等紫外或可见光吸收基团，无法直接用紫外和可见光吸收法 检测，需先将氨基酸衍生转化成具有较强紫外或者荧光吸收的衍生产物。本文采用反向高效 21、氯 液相色谱结合柱前衍生检测氨基酸。一般用于柱前衍生的试剂有邻苯二甲醛(OPA)t10’1 甲酸芴甲酯(FMOc．E1)t1 剂都有各自的优缺点，OPA与氨基酸在室温下反应lmin即可形成具有强荧光的衍生产物， 但是它仅与一级氨基酸发生反应，与二级氨基酸