PCRRTPCR常见问题及分析.pptVIP

PCR常见问题分析及解决方案 重庆升博生物科技有限公司 SHENGBO BIOTECH CO., LTD. PCR技术的发明 1983 Kary Mullis 发明 1985 开始有文章发表 1993 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学研究领域 pcr动画.exe PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP 耐热聚合酶 ddH2O 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 （ PCR 实验的不同需求） 1 Taq酶——扩增效率最高 发现 1969年，美国黄石国家公园温泉 活性 5‘-3’ DNA聚合酶活性 强 5‘-3’ DNA外切酶活性 弱 荧光探针（定量PCR方法） 3‘-5’ DNA外切酶活性 无 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆 生产质检 诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，