18 基因组学与后基因组学课件.ppt

YAC 载体的工作原理(P442图18-10): BamHⅠ切割后形成微型酵母染色体→EcoRⅠ切割sup4 内部的位点形成染色体的两臂→与外源DNA 在该切点相连形成人工酵母染色体→转化入酵母菌→通过复制、分裂，克隆大片段DNA 。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。 YAC的主要缺点：1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；3．插入DNA片段的分离和纯化困难，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。4．转化效率低。 18.4.2 细菌人工染色体 细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象；转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文库筛选方便。 选择标记：氯霉素抗性基因等。 * 18 基因组学与后基因组学 18.1 人类基因组计划与基因组学 1 基因组：生物体配子中所包含的全部染色体及其基因，还包括细胞质基因组。 基因组学:研究生物体内基因组的分子特征。 以整个基因组为研究对象，而不是以单个基因为 单位作为研究对象。 主要目标： 认识基因组的结构、功能和进化； 阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系； 充分利用有效资源， 预防和治疗人类疾病。 2 人类基因组计划 1990年，国际人类基因组计划启动； 基因组计划具体分为： ① 构建基因组的遗传图谱； ② 构建基因组的物理图谱； ③ 测定基因组DNA的全部序列； ④ 绘制基因组的转录本图谱； ⑤ 分析基因组的功能。 3、人类基因组的特点 大小：3.2×109bp; 基因和基因相关序列：1200 Mb，其中基因编码的序列为48 Mb，基因相关序列为1152 Mb，包括假基因、基因片段和内含子以及非翻译区； 基因间相关序列：2000 Mb，其中散在重复序列（IRS）为1400 Mb,包括64 Mb长散在核元件、420 Mb短散在核元件、250 Mb长末端重复序列和90 Mb的DNA转座子；基因间DNA序列还包括600 Mb的其他的基因间区域序列，包括90 Mb的微卫星序列和510 Mb的各种间隔区。 4、水稻基因组计划 18.2 基因组图谱的构建 利用现有DNA测序方法，每个测序反应通常只能得到800个核苷酸的序列。 所以，小基因组物种常用鸟枪射击法。 大基因组测序存在两个问题： 片段数(n)庞大，片段间连接和装配非常复杂，重叠数为2n2~2n。 基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时容易出错。 大基因组测序方法： 克隆连续序列法 定向鸟枪射击法 克隆连续序列法：DNA切割成长度为0.1-1Mb的大片段→克隆到YAC或BAC载体上→分别测定单个克隆序列→再装配连接成连续的DNA分子。 定向鸟枪射击法：以基因组图谱中标记为依据→测序装配和构建不同DNA片段的序列。 基因组图谱根据构建的途径，可分为两种： 遗传图谱：根据遗传性状（如已知基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表型性状）的分离比例→将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱。 物理图谱：将各种标记直接定位在基因库中的某一位点上。 1 遗传图谱： 1）图谱标记：可用基因和DNA作为鉴别的标记。 ①基因标记：基因控制性状的表现，利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记→根据连锁交换原理来分析基因之间的连锁关系和遗传距离→绘制连锁图谱。 缺点：基因数目有限，所构建的遗传图谱不详细，标记间的遗传距离较大。 ② DNA标记 RFLP（限制性内切酶多态性）：限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列。由于DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的酶切位点的改变，当用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA时，致使酶切片段长度发生变化，个体间出现限制性片段长度的差异。DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。 如一对同源染色体的两个DNA分子,一个具有某种酶切位点,另一个无此位点,酶切后形成的DNA片段长度就有差异,即RFLP.根据该等位基因的遗传,将RFLP作为标记定位在基因组的某一位置上。 RFLP表现为共显性遗传。 SSLP（简单序列长度多态性）：SSL