骨髓间充质干细胞MSCs培养方案.pdfVIP

骨髓间充质干细胞培养方法 大鼠骨髓间充质干细胞培养方法 仪器和材料 磁力搅拌器 电子天平 水浴振荡器 pH 计 真空泵 离心机 血球计数板 1 x 100ml 量筒 1 x 1L 容量瓶 1 x 500ml 玻璃烧杯 2 x 500ml 带盖无菌玻璃瓶 1 x 100ml 带盖无菌玻璃瓶 1 x 0.22um 无菌滤膜 2 x 100mm 无菌培养皿 4 x T25 无菌培养瓶 4 x 15ml 无菌离心管 2 x 转子 2 x 5ml 无菌移液管 1ml 无菌枪头 封口膜 脱脂棉 3 x 手术剪 2 x 直头镊子 1 x 骨钳 2 x 手术刀 （刀柄+刀片） 1 x 100ml 塑料烧杯 （盛废液） 2 x 100ml 玻璃烧杯 低糖DMEM 培养基粉末 胎牛血清 PBS 双抗 75%酒精 SOLUTION PREPARATION 溶液制备  所有的水溶液均用二蒸水配制。  先将试剂在烧杯中用少量二蒸水溶解，然后补加至最终体积。  用容量瓶配制溶液。 75% 乙醇 乙醇与二蒸水以体积比3：1 配制 Dulbecco’s Modified 将DMEM 粉末溶于二蒸水中，用NaHCO3 调节pH 值至 Eagle Medium 7.2-7.4，终体积为1L。 (DMEM)-低糖培养基 过滤灭菌 高糖DMEM+ DMEM 培养基与胎牛血清以及双抗以89：10：1 体积比混合 10%FBS+1%双抗 台盼兰溶液 将0.04g 台盼兰溶于 10ml PBS 中, 混合均匀，使用前过滤 (0.4% w/v) Phosphate Balance Saline NaCl 8g (PBS) KCl 0.2g Na HPO ·12H O 2.89g 2 4 2 KH PO 0.2g 2 4 终体积1L 高压灭菌. 原代培养： 密度梯度离心法 1) 取鼠龄3-4w ，体重70-120g 的SD 大鼠3-4 只 （雌雄不限）； 2) 将 SD 大鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有约 300-500ml 75%酒精的 1000ml 烧杯中浸泡 5min； 3) 用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤 和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用5-10ml 75%酒精浸泡5min 后移入超净工作台中； 4) 用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS 和无血清 培养基冲洗2~3 次后，移入另一无菌培养皿中。用镊子和骨钳固定股骨，分别用10mL 注射器在骨两端钻孔； 5) 用5ml （或1ml）注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔， 用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2~3 次； 6) 在15ml 离心管中加入5mL Ficoll 分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意 一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为