TSS法制备大肠杆菌感受态细胞.doc

TSS法制备感受态 取感受态种子接种于含有LB的2ml试管中，37度振荡培养 将上述培养液用LB按1：100稀释后，37度振荡约3h（OD为0.5±0.03） 把培养物放在冰上冷却后，2500rpm 4度离心10min，收集菌体，弃上清 使用前准备好1X TSS(10% W/V PEG 3350, 50mM MgCl2, 85%LB) 将收集到的菌体重悬于1X TSS（每100ml 培养物溶解于10ml 的1X TSS）, 混匀。注意保持冰上操作 用1.5ml EP管冰上分装，100μL/管，先放在液氮中速冻一下，后放于-70保存 TSS方法制备感受态细菌（一步法制备感受态细菌）TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、??准备工作1、??缓冲液1×TSS的配制：事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30 ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。3、??若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。二、??感受态制备程序：1、前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养（12-16h）,按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 ml LB培养液中，于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5 ml）的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100 ul/份，全部冰上操作，－80度保存。三、??转化时取一管（100 ul）感受态细菌，（冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5ul DNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。 制备高效率感受态的方法 BIOX.CN 2005-4-15 23:40:00 来源：丁香园 　 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.TB溶液*TRANSFORMATION BUFFERPIPES 3.0G 10mMCaCl2.2H2O 2.2g 15mMKCl 18.6g 250mMadd water up to 950ml用 5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存.但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒.【zihudie】（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（5）重复第4步操作。（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。本法效率极高,建议大家采纳【yog】1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM