HPLC常见问题及对策.doc

HPLC常见问题及对策 1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？ 关于漂移问题：  温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定  流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等  柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题  流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定  泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。  流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？  筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。  存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子  可能柱超载，减少进样量。 3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法  样品量不足，解决办法为增加样品量  样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子  样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器  检测器衰减太多。调整衰减即可。  检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数  检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。  检测池中有气泡。解决办法为排气。  记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。  流动相流量不合适。调整流速即可。  检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？  泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；  比例阀失效，更换比例阀即可；  泵密封垫损坏，更换密封垫即可；  溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；  系统检漏，找出漏点，密封即可；  梯度洗脱，这时压力波动是正常的。 5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？ 这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。 如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。 6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？ 柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。  拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；  把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；  将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。  更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 7.色谱双峰产生的可能及判断和处理 HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。下面根据本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。 色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。 1 色谱柱 如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效