猪附红体分离方法的比较.docVIP

第26卷第4期 2004年12月 延边大学农学学报 Journal of Agricultural Science Yanbian University Vol .26 No. 4 Dec .2004 猪附红细胞体解离方法的比较 贾立军，柴方红，张守发 (延边大学农学院，吉林龙井133400) 摘要:为建立一种简便易行的猪附红细胞体的解离方法，对同一患有附红细胞体病猪的血液 样本进行解离，比较了两种方法对附红细胞体的解离效果.结果表明，应用水浴法解离附红细 胞体较化学试剂法解离效果好;再用超声波粉碎，经Sephadex G一200柱层析，即可取得纯度 较高、提取量较大的附红细胞体抗原成分.为进一步研究附红细胞体的生物学特性及抗原分析 奠定了基础 关键词:附红细胞体;猪;解离方法 中图分类号:S853.32文献标识码:A文章编号:1004-7999(2004)04-0229-04 0前言 附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于人和动物的红 细胞表面、血浆和骨髓中，以高热、贫血、黄疽为主要临床症状的人畜共患传染病〔‘〕.自1932 年Doyle在印度首次报道了猪附红细胞体病以来，随后在全球范围内从仔猪到怀孕母猪都 发现了附红细胞体.在我国，许耀成等(1982年)首次在江苏南部红皮病血液中查到了猪附 红细胞体，现在，猪附红细胞体病在全国范围内已呈现明显的蔓延趋势，尤其在北方省市流 行严重〔2l.随着发病率和死亡率的逐年递增，已给养猪业带来极大的经济损失，但对此病的 病原生物学研究、血清学诊断及防治研究还处于初级阶段.因此，应建立一种简便易行的猪 附红细胞体的解离方法，以期为附红细胞体病的病原学和诊治等研究提供依据. 1材料与方法 1.1病料采集 选取1头有明显临床症状、自然发病的附红细胞体病猪制作鲜血压滴标本，镜检，观察 到红细胞的附红细胞体感染率为95 VRO以上，每个红细胞的感染强度为8一12个不等.颈静 脉无菌采取抗凝血80 mL，等份分装，4℃冰箱保存备用. 1.2附红细胞体的解离 1.2.1化学试剂法 将40 mL附红细胞体病猪的抗凝血以1 500 r/min离心15 min，弃掉上清液和中间的 白细胞层.将剩余的红细胞用pH值为7. 2的PBS洗涤3次.每管加人与红细胞等体积的 收稿日期:2004-10-15基金项目:国家自然科学基金项目(项目批准号 作者简介:贾立军(1978一)，男，吉林镇资人，延边大学农学院动物医学系，在读硕士.张守发为通讯作者， ICI ; 0433一3261730 , E-mail : shoufazhang@ sina. com. 延边大学农学学报 第26卷 pH值为7.2的PBS+吐温一20十EDTA混合溶液后，用振荡器振荡1一1. 5 h，以4 000 r/min离心30 min，取上清液，再以18 000 r/min离心20 min，沉淀即为附红细胞体. 1.2.2水浴法 取另外40 mL附红细胞体病猪的抗凝血，洗涤方法同上.每管加人少许的pH值为7.2 的PBS，置水浴锅中脱离3-5 min，以4 000 r/min离心30 min，取上清液，再以18 000 r/min 离心20 min，沉淀即为附红细胞体. 1.3附红细胞体抗原的提取 在收集的分离物中，分别加人等量的pH值为6.4的PBS，以18 000 - 20 000 r/min离 心20 min，弃去上清液，反复洗涤3次，加少许pH值为6. 4的PBS与沉淀混匀.置于 一20℃冰箱中反复冻融3次，进行超声波粉碎处理30 s，处理3次后，以2 000 r/min离心 10 min，上清液即为附红细胞体粗抗原.再将提取的粗抗原进行Sephadex G一200柱层析， 用0.01 mol/1_的pH值为7.0的PBS洗脱，以0.5 mL/min的流速，用自动部分收集器按每 管1 ml_收集;然后用UV一754型紫外分光光度计测定260 nm和280 nm下的光度值，再计 算各管蛋白浓度，绘制出洗脱曲线. 2结果与分析 2.1附红细胞体的解离 分别采用水浴法和化学试剂法，对同一病猪血液样本解离的附红细胞体进行镜检观察 解离效果(表1). 表1猪附红细胞体两种解离方法解离前后镜检结果的比较 Fable I The comparison before and after separation of the two methods to E .suis by microscope examination 镜检项目 Microscope examina