基于快速定点突变研究含硒人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c的催化活性.pdfVIP

V01．35 高等学校化学学报 No．10 2014年10月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSl7兀ES 2109～2113 基于快速定点突变研究含硒人Zeta型 c．1 谷胱甘肽硫转移酶1 c的催化活性 郭 笑，于 扬，陈 龙，王铭铄，金梦梦，刘广娜， 张黎，李涛，高壮，魏景艳 (吉林大学药学院，长春130021) 摘要先将人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c一1C(hGSTZlc．1 c)中非催化中心的Cys．137，Cys．154，Cys．165和 大肠杆菌表达系统将其特定地转化为Sec，即把GPx的催化基团引入到hGSTZlc一1C中，高效地获得了具有 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力的模拟酶．其中制备的3个含硒突变体15C，14C／15C和17C均显示出明显 的GST活力几乎丧失，表明Ser一14和Ser一15在催化反应中发挥着重要作用，但前者主要参与底物结合，后者 更侧重于催化． 关键词快速定点突变；谷胱甘肽过氧化物酶；人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶 中图分类号0629．7 文献标志码A o． 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一类重要的抗氧化酶，在机体抗氧化损伤中扮演着重要角色’1’2 研究发现，GPx与细胞生长、信号转导、凋亡、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化及炎症等多种正常生理 和病理过程相关旧J．机体内缺乏GPx会引发免疫应答障碍、糖尿病、心血管疾病和癌症等多种疾 病‘4“J．然而，天然GPx来源有限、分子量大且稳定性差，限制了其在医药领域的应用¨’8I．因此，研 入；(2)催化中心能够识别并结合底物谷胱甘肽(GSH)‘9，10J．近年来人们致力于寻找能够结合GSH的 分子，并在此基础上进行化学修饰或基因工程改造，以期获得具有较高GPx活力的模拟酶一’““…． J．该基序在空间位置上靠近GSH 其活性中心是由3个保守的Serl4-Serl5一Cysl6残基组成的SSC基序¨718 c一1 的巯基，且结构稳定，因此hGSTZlc被视为模拟GPx的理想骨架蛋白．Zheng等‘1引通过化学修饰的 方法制备了具有较高活力的GPx模拟酶，但由于反应条件剧烈，导致含硒蛋白的收率很低．Yin 白结构与催化活力间的关系，但仍无法克服含硒蛋白产率低的缺点．此外，Yu等。11。利用半胱氨酸缺 蛋白酶．然而，该表达系统会将目标蛋白的所有Cys都转变为Sec，这种非预期的转变对蛋白结构产生 了很大影响，进而影响其催化活性旧0I．利用Cys与Ser在结构和性质上的相似性，本研究首先把 变在催化中心的特定位点引入Sec，以期获得具有GPx活力的模拟酶，并研究了其催化活性的变化 规律． 8_ 收稿日期：2014-02-11．网络出版日期：2014-09一l 470110000006)和大学生创新训练计划(批准号：2013873333)资助． 联系人简介：魏景艳，女，博士，教授，主要从事人工酶研究．E-mail：jingyanweijluedu@163．COB 万方数据 高等学校化学学报 1 实验部分 1．1试剂与仪器 E．coli (Kana7)由德国慕尼黑大学AugustBock教授及法国蒙彼利埃第一大学Marie．PauleStrub惠赠；含 hGSTZlc一1c基因的pQEZl(Amp。)质粒由澳大利亚BoardP．G．教授惠赠；pColdI质粒和限制性内切酶 公司；分离纯化介质购于Pharmacia Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠多克隆抗体购于SantaCruz公司；其它化学试剂均为 国产