圆叶牵牛毛状根的诱导及培养.pdfVIP

2011年6月 第 l3卷 第6期 中国现代中药 ModernChineseMedicine Jun．2011 Vo1．13 No．6 圆叶牵牛毛状根的诱导及培养 李丽英 ，杨世海 ，徐大卫。，张悦 (1．吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2．中国药材公司，北京 100195) [摘要] 目的：利用发根农杆菌，R1601，1000，1025，15834诱导约用植物圆叶牵牛产生毛状根。方法：采 用共培养方法，通过对外植体、菌种、浸染时间、预培养 、共培养 、外源激素等L大J素对转化率的影响。结果：利川 发根农杆菌 1601，预培养60h的叶片、叶柄为转化材料，感染6～8min，加入 1mg·L NAA转化率最高。结论： 圆叶牵牛毛状根的诱导成功，为其遗传转化提供了依据。 [关键词] 圆叶牵牛；发根农杆菌；毛状根 圆叶牵牛Pharbitispurpurea(L．)Voigt以干燥成 然后用75％乙醇消毒 30S后，用无菌水清洗 3～5 熟的种子入药，又名黑丑、白丑，现收载于 《中国 次，再用0．1％HgC1浸泡 6min后，用无菌水冲洗 药典》2010版。圆叶牵牛主要成分牵牛子苷，具有 3～5次，最后用无菌滤纸将种子表面的水分吸干 ， 泻下、利尿、兴奋离体兔肠和离体大 鼠子宫平滑肌 将种子接种到MS(不加任何激素)培养基 中 放于 以及对猪蛔虫有驱虫效果 ¨J。迄今为止，有关牵牛 温度 25℃，光强 2000lx、光照 12h·d 的条件下 种子化学成分和药理活性的报道很少，仅有 日本朝 培养，待 7d后种子萌发至子叶完全张开后，作为 比奈太彦等 从中分离得到了7种大环 内酯类成分 遗传转化用无菌外植体。 以及陈立娜 等报道的蒽醌和酚酸类成分 。 1．2发根农杆菌的活化 发根农杆菌具有诱导植物生根的生物学特性， 无菌条件下，接种针挑取保存菌液，于YEB同 而且所产生的毛状根能合成该植物特征的次生代谢 体平板上划线培养，28℃放置于暗培养条件下培 物，因此发根培养技术成为生产次生代谢物的一条 养，直到长出菌落。挑取一个单菌落接种于20mL 可靠和有效途径 J。利用发根农杆菌进行次生代谢 附加有 Kan(50mg·I ) 的液体 YEB培 养基， 物质生产，具有许多适应工业化生产的特点，如无 28 ，摇床摇速 180r·min 条件下培养24h复苏 需添加外源生长素、迅速 自主生长、遗传稳定性高、 此时YEB液体培养基 由接种前的透明的红棕色变成 能合成植物特有的次生代谢物，而且其含量往往比 浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出。此时的菌液 植物 自身合成的含量还高 J。毛状根不但可以合成 还要进行再次活化，活化时取 1mL复苏菌液加入 植物特征性次生代谢物，也可以产生许多新的化合 50mL的YEB液体培养基中，28℃，180r·min 培 物，为新药筛选提供大量的材料。目前，火 圆叶 养 12h，活化菌液达到生长对数期，此时菌液即可 牵牛毛状根的研究尚未见报道。本实验对圆叶乍牛 作为感染用。 毛状根诱导条件进行了筛选，为圆叶牵牛遗传转化 1．3圆叶牵牛毛状根的诱导 提供依据，为充分利用圆叶牵牛资源带来更大的现 在无菌条件下，将 圆叶牵牛无菌苗的幼嫩叶片 实意义。 剪成 0．5em 大 小 的片段，叶柄、茎段 各 剪成 1 材料与方法 0．5cm的小段。每个样品在同体 MS(不添加任何激 1．1圆叶牵牛无菌苗的培养 素)培养基上接种 l0片(段)，并且各样均做3次平 选取饱满成熟的圆叶牵牛种子 (经吉林