HBV基因体外表达的研究现状.docVIP

HBV基因体外表达的研究现状 摘要：体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白质快速分析鉴定，基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究，如蛋白质和蛋白质的相互作用，蛋白质与DNA的相互作用，蛋白质与RNA的相互作用等。 关键词:乙型肝炎病毒；基因表达；体外翻译 人乙型肝炎病毒(HBV)不仅能引起人类急慢性肝炎，而且还可导致原发性肝癌的形成[1]。然而，遗憾的是至今尚无有效的办法来防治HBV的感染。近年来，由于基因重组技术的发展，加速了HBV的研究进程，HBV的基因结构，转录及增殖特性已基本弄清，并且整合在原发性肝癌细胞染色体上的HBV DNA序列亦被证实。同时采用多种载体系统重组HBV DNA片段，在体外已成功地表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎核心或e抗原(HBcAg/HBeAg)，可望采用基因工程的方法来制备合适的HBV疫苗替代昂贵的HBV血源性疫苗。 目前，用来研究HBV基因表达的方法大体上可归纳为如下三种:(1)体外转录克隆的HBV DNA[2]；(2)将HBV基因整合到人，小鼠及大鼠细胞的染色体上进行表达[3]；(3)将HBV DNA片段或序列重组在细菌质粒或病毒载体上，而后转染原核细胞或哺乳类细胞进行表达。 完整的HBV颗粒由外壳蛋白(HBsAg)与核衣壳组成，核衣壳由HBcAg构成，其 核心部分含有病毒DNA,DNA多聚酶/逆转录酶，蛋白激酶及DNA结合蛋白[4]，另一种存在于急慢性乙肝病人血清中呈可溶性状态的蛋白称之为HBeAg，它是由HBV C基因(不含前C区)编码的，当用2-琉基乙醇，热或轻微的蛋白酶处理HBV核心颗粒时，可使HBcAg转变成HBeAg，亦有人认为HBeAg能形成多聚体形式，可能是病毒核心的一结构成分[5]。 HBV的基因结构与功能 HBV基因组是一不寻常的特异性结构，它是一环形的部分双股的HBV分子。其中完整的链称为长链或负链，由3200左右核苷酸组成，短链又称为正链，其核苷酸数目相当于长链的50%-100%。两条链的5′—末端之间的碱基互补构成粘性末端，维持其环状结构。在粘性末端的两侧各有一个由11个碱基对（bp）组成的正向重复顺序(DR)，位于核苷酸1824和核普酸1590，分别称为DR1和DR2。 已证明HBV DNA的S(+)链不管多长均不具有编码蛋白的功能即不含有开放读码框架，而L(-)链则含有所有HBV的蛋白密码, 其转录的4个ORF，分别称为S，C，P和X，P区最长与另外的三个区重叠，这样，L(-)链被阅读一次半。 S区编码HBV包膜蛋白，分为前S1区，前S2区及S基因。HBV各亚型的S基因与Pre-S2的长度是一致的，而Pre-S1区变化较大，adw亚型比ayw亚型的Pre-S1区约长33个核苷酸。Pre-S1与Pre-S2的变异率相当于S基因的两倍，这说明S基因编码病毒外壳的主要结构蛋白，而Pre-S区的氨基酸顺序与病毒的包装关系较小，但影响宿主的免疫应答。以前认为S蛋白抗体具有中和作用，近来研究表明Pre-S2编码的55个氨基酸多肽的免疫原性明显高于HBsAg的S区，该多的N-末端的肽26个氨基酸含有代表主要抗体结合部位的决定簇。Pre-S1区编码的108个（adw亚型）或119个（ayw亚型）氨基酸多肽,连接在“中”蛋白（后述）的N-末端，并且位于病毒颗粒表面，亦具有较高的免疫原性。Pre-S1多肽在小鼠体内具有T、B细胞水平上的免疫活性，在人急性HBV感染过程中，可产生Pre-S1特异性体液免疫反应，不过，Pre-S1特异性抗体是否参与休内病毒的清除过程尚不清。 C基因区编码核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。该区有两个起始密码子，一个位于核苷酸1814，另一个位于核苷酸1901，二者之间含有的29个密码子称为前C区（Pre-C），其它则称为C区。核苷酸第1814-2450序列编码HBcAg，而核苷酸第1901-2450序列编码HBeAg。此外，在前C第1816核苷酸处有一缺口，推测该区为HBV DNA整合入宿主DNA的部位，从而解释了为什么HBV DNA整合入宿主细胞DNA时，通常只表达HBsAg，而不表达HBcAg或病毒颗粒。 P区转译的产物是富含组氨酸的碱性蛋白，分子量约为90,000道尔顿与DNA多聚酶相似。比较这种蛋白的氨基酸序列，结果发现其覆盖S基因末端区所编码的氨基酸顺序与所有反转录病毒和花椰镶嵌病毒的反转录酶部分同源，因而认为P区编码具有反转录酶活性的病毒DNA多聚酶。 X区编码145到154个氨基酸的多肽，其功能尚不清楚，用合成多肤的抗体从HBV感染的肝组织中检测出相应的多肽为P28，而在原发性肝癌患者血清中测得与HBxAg起