烟草碱性β-1%2c3-葡聚糖酶基因转化‘DoubleMariachiPink’洋桔梗研究.pdfVIP

摘 要 洋桔梗（Eustoma grandiflorum ）属龙胆科一、二年生的草本观赏 植物，原产于美洲中部地区。它具有色彩丰富、花朵美丽等特点，作 为切花新秀，越来越受到人们的喜爱，是近年来世界上十分流行的十 大切花之一。 然而，洋桔梗在栽培中很容易受真菌的侵害，由真菌引起的病害 占其总病害的80%。本研究以洋桔梗‘Double Mariachi Pink ’品种为 试验材料，将烟草抗真菌的 β-1,3-葡聚糖酶基因，通过农杆菌介导法 转入其中，以期培育出抗真菌的洋桔梗新种质。 首先，以烟草基因组DNA为模板，根据烟草‘Samsun ’抗真菌 的碱性β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物，利用PCR方法扩增出特异 的目的基因，并对其进行了生物信息学分析。该序列（GenBank 登 录号：EU867448 ）全长1868bp，包含2个外显子和1个内含子；除终 止密码子外，共编码359个氨基酸。该酶分子量为28.4kD ，pI为9.72， 是一个碱性蛋白。该酶蛋白与颠茄、马铃薯等茄科植物的β-1,3-葡聚 糖酶氨基酸序列同源性分别达到89%和81%。 然后，将该基因回收克隆，与pBI121重组，成功构建了植物表达 载体pBI121-glu ，并将其导入农杆菌LBA4404 ；再利用本实验室已优 化的洋桔梗叶片遗传转化体系，通过农杆菌介导法转化洋桔梗 I ‘Double Mariachi Pink ’品种。 最后，对洋桔梗的卡那霉素抗性再生植株进行检测。32 个再生 株系的抗性苗经生根筛选，有 17 个株系生根，生根率为 53.1%；对 这 17 个株系进行 GUS 组织化学染色， 7 个株系有 gus 基因表达；为 了防止gus 基因整合却未表达的情况，又对这 17 个株系进行 PCR 扩 增，有 10 个株系呈阳性，其中 6 个株系为 gus 基因表达株；最后对 该 6 个 PCR 和 GUS 组织化学染色阳性的株系进行 Southern 杂交，最 终得到 3 株转化株系，阳性率为 9.4% 。 关键词：洋桔梗；β-1,3-葡聚糖酶基因；生物信息学；遗传转化；分 子检测 II Transformation of Eustoma grandiflorum ‘Double Mariachi Pink’ with antifungal β-1,3-glucanase gene Abstract Eustoma grandiflorum is Gentianceae biennial herbs, be produced in central region in America at first. It has the color, the blossom beauty etc.characteristics, be the cut new talent flowers, be liked by the people more and more, the row cut flowers is one of the most important cut flowers in the world in recent years. However, the production of Eustoma grandiflorum is very suscep- tible to fungal damage in the practice, the diseases which caused by fungal diseases accounted for 80% of the total. In the research, Eustoma grandiflorum culti