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中国试剂网 3.9.187 利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA 探针 1. 在一个0.5 ml 的薄壁微量离心管中设置下列扩增/放射性标记反应体系： 10×扩增缓冲液 5.0 μl 10 mmol/L dNTP 溶液 1.0 μl 0.1 mmol/L dCTP 1.0 μl 20 μmol/L 正向寡核苷酸引物 2.5 μl 20 μM 反向寡核苷酸引物 2.5 μl 模板DNA （2～10 ng 或约1 fmol） 5～10 μl 10 mCi/ml[ α-32P] dCTP ( 比活性3000 Ci/mmol) 5.0 μl 水 加至48 μl 在反应体系中加入2.5 单位耐热DNA 聚合酶。轻敲管壁以混合各组分。 2. 如果热循环仪无加热盖，可加一滴 （50 μl ）轻矿物油或一粒石蜡于反应混 合物之上，以防止样品在反复加热及冷却的循环中蒸发。将微量管放入热循环仪。 3. 通过变性、复性和聚合扩增样品，反应时间见下表。 循环数 变性 复性 聚合 30 个循环 94 ℃ 30～45s 55～60℃ 30～45s 72 ℃ 1～2 min 最后一个循环 94 ℃ 1 min 55 ℃ 30s 72 ℃ 1 min 4. 从热循环仪中取出反应管，用微量移液器尽可能地从反应液上层吸去矿物 油。用50 μl 氯仿抽提反应液，以除去剩余的矿物油。室温下离心1 min 以使液 相与有机相分离。 5. 吸去上层水相，转移到一个清洁的微量管中，加入载体tRNA （10～100 μ g ）或糖原 （5 μg ），用等体积的4mol/L 乙酸胺和2.5 体积的乙醇沉淀DNA ，放 置于-20℃ 1～2 h 或-70℃ 10～20 min 。4 ℃下以最大速度离心5～10 min 收集沉 淀的DNA 。 6. 将DNA 溶于20 μl TE(pH 7.6), 用Sephadex G-75 离心柱层析除去残存未掺 入的dNTP 和寡核苷酸引物。 7. 用液体闪烁计数仪测定 1.0 μl 离心柱外水体积的放射活性。贮存剩余的放 射性标记DNA 于-20℃以备用。