牛肌腱胶原纤维提取条件优化及其结构表征.pdfVIP

助 锨 材 料 2012年增刊I(43)卷 牛肌腱胶原纤维提取条件优化及其结构表征。 刘新华1”，但年华1”，胡 杨1”，肖世维1’2，但卫华1’2 (1．I匹lJil大学制革清洁技术国家工程实验室，四川成都610065； 2．四川大学生物医学工程技术研究中心，四川成都610065) 摘要： 以牛肌腱为原料，通过酸一酶结合法提取胶 高的前提下，还要保证其制品的纯度和结构的完整，是 原纤维，比较不同时间、pH值、酶用量下的胶原纤维提 目前研究的重点。 取率以及可溶性胶原含量，从而得到提取胶原纤维最 本文以牛肌腱为原料，利用酸一酶结合浸提胶原纤 优工艺，并用SDS．PAGE电泳、DSC、IR、SEM、AFM维，实验采用正交设计法，通过比较不同浸提时的时 对胶原纤维进行了结构表征。研究结果表明，在4℃ 间、酶用量、pH值下产物的提取率及可溶性蛋白含量， 下，酸一酶结合法水解的最佳条件为，时间40h、pH值从而获得最佳工艺，并对最优条件下提取的胶原纤维 为2．5、酶用量1．0％。该条件下所得胶原纤维提取率进行结构表征。 较高，红外特征峰明显，分子量大且分布窄，变性温度 2 实 验 为66．7℃；SEM显示胶原纤维呈现孔隙均匀的三维网 2．1试剂与仪器 状结构，孔径约为100～300Mm；AFM观察到胶原纤 维以单根原纤维、纤维束等形式存在，明暗相间的横纹 间距为60．35nm。综合认为制备得到了具有天然三股纯)，上海有机化工试剂研究所；新鲜牛肌腱，成都郭家 螺旋结构的胶原纤维。 桥市场；高速离心机LGl0-24A，北京医用离心机厂； Zone 关键词：牛腱：胶原纤维；纤维束 冷冻干燥机Free 中图分类号： R318．08 文献标识码：A 动双重纯水蒸馏器，上海沪西分析仪器厂；差示扫描量 文章编号：1001—9731{2012)增刊工一0136—05 1 引 言 胶原纤维是细胞外基质的主要骨架成分，广泛存 日本电子株式会社。 在于皮肤、骨、肌腱等中，具有支撑和保护作用。胶原 2．2胶原纤维的制取 纤维是原胶原分子的聚集体，在结缔组织中排列成柬， 2．2．1牛肌腱的纯化 彼此交织。原胶原分子间通过侧向共价交联，相互呈 将新鲜牛腱洗净，剔除肉质、血管及边缘软骨，并 阶梯式有序排列聚合成直径50～200nm、长280nm至尽量除去表面筋膜，切成lmm的薄片，用75％的乙醇 数微米的原纤维，这些原纤维组成胶原纤维。相比胶 浸泡24h，用双蒸水多次漂洗，再用丙酮浸泡24h脱 原分子，除拥有胶原的四级结构外，保留有更多的天然 脂，双蒸水洗净，风干。称取一定量冷冻干燥后的牛肌 胶原空间结构特征，因而其具有很好的抗张强度、韧 腱，加入一定量的双蒸水，4℃恒温条件下用切碎机打 性。当制成海绵时，由于胶原纤维分子量更大，空间结 碎、匀浆，每次匀浆时间为30min，直至组织悬浮不见 构更复杂，遇到体液时，不易流失、变形和降解，稳定性 组织碎片为止，置于冰柜4℃冷却。 更高。胶原纤维作为生物材料前景广阔，目前已应用 2．2．2酶法提取胶原纤维 于临床的有组织工程支架，止血、抑菌海绵等。多年来 酶法水解的影响因素主要有酶用量、水解pH值、 提取胶原纤维的方法比较少，多以酸溶、盐析提取Ⅲ， 水解时间以及水解温度。根据前期研究的成果[5]，本 Huc等口。就通过酸溶制取了胶原纤维，纯度很高而且 文将水解温度这一因素固定，即酶法水解在4℃的条 很好的保持了天然的三股螺旋结构，可作为生物医学 件