流式细胞仪标本的制备.pdfVIP

中国试剂网 2.4.69 流式细胞仪标本的制备 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术 发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以 及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血 病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离 纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于 FCM 检测的标本准备，染 色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后 的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的 结果。 (一) 原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细 胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和 阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二) 操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用 10％FCS RPMI1640 调整细胞浓度为 5 ×10 ６～１×10 ７／ml ↓ 取 40 μl 细胞悬液加入预先有特异性 McAb(5～50 μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加 50 μl 1 ∶20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4 ℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入 50 μl 工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 中国试剂网 2.4.69 ↓ 4 ℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为 FCM 制备标本，一般加入 1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入 100～500 μl 固定液) ↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存 5～7 天) (三) 试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液(见附录) 。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 ( 四) 注意事项 1. 整个操作在 4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防 止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10,