牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间充质干细胞异位移植实验研究.pdf

中文摘要 牙本质基质蛋白l基因转染骨髓间充质干细胞异位 移植的实验研究 摘 要 目的：牙齿是口腔颌面部的重要组织结构，牙齿的缺失 不仅影响面部的美观，还对咀嚼和发音等造成不良影响。目 前对于缺失牙多以义齿或种植牙修复。近年来组织工程学的 发展为组织器官的修复开辟了一条新的途径，牙齿的组织工 程学研究也不断的深入。作为包括牙齿在内的多种组织工程 的种子细胞，骨髓间充质干细胞(bone stem mesenchymal matrix 点。本文将牙齿发育相关蛋白牙本质基质蛋白l(dentin protein 态的变化并将转染细胞以悬液的形式异位植入自体和异体 宿主的股部肌肉内，2个月后取材组织学及免疫学观察其分 泌基质及矿化的能力，为其今后作为种子细胞构建组织工程 化牙齿提供实验依据。 方法： 1猪BM．MSCs体外分离与培养 中国农业大学实验动物研究所购买lO月龄中国实验小 型猪两只，分别编号为P．I、P．II。3％戊巴比妥钠耳后肌肉 麻醉，用16号穿刺针于股骨大转子处穿刺，抽取骨髓4ml， 件下培养。5天后全量换液，以后每周2次换液。两只实验 中文摘要 动物的骨髓间充质干细胞分别命名为I．BM．MSCs、II ．BM．MSCs。 2BM．MSCs的表型鉴定 医科大学第四医院肿瘤研究所)。 3DMPl基因转染及筛选 第三代细胞用于基因转染。转染前用含lO％FBS的 培养至60％融合。采用脂质体介导方法将DMPl基因转染至 G418500lag／ml进行筛选，同时以未转染细胞作为对照。每 4天换液1次。14天后未转染的细胞死亡，转染的细胞克 隆生长，扩大培养备用。转染后的细胞分别命名为I 1。 ．BM．MSCs．DMP1、II．BM．MSCs．DMP 4转染细胞的免疫组织化学检测 DMPl培养于6孔板的玻片上，免疫组织化学SP法染色检 测DMPl、牙本质涎蛋白(dentin 抗体滴度为1：200。同时以未转染的细胞作为对照。 5转染细胞肌肉内异位植入 7／rnl。 DMPl，并制备成细胞的PBS混悬液，调整浓度至l×10 采用注射植入的方法，每一肢体注射四个位点，每点注射 200}tl。具体情况如下：编号为P．I的小型猪的左、右下肢 中文摘要 的左、右下肢股部近心端内侧肌肉内分别植入I．BM．MSCs． 6标本取材及组织学和免疫组织化学观察 2个月后处死实验动物，并切取细胞植入部位的肌组织， 立即置于福尔马林中固定。之后进行组织学染色观察植入细 胞的情况，是否有牙本质样钙化形成。并用免疫组织化学SP 法染色检测DSP的表达。 结果： l成功分离并培养出BM．MSCs，流式细胞检测显示为间充质 干细胞来源。 疫组织化学染色结果显示转染后的细胞DMPl、DSP呈阳性 表达。 3自体植入组组织学显示植入细胞在体内分泌基质并矿化， 有类牙本质样结构形成。免疫组织化学显示埋入矿化组织内 的细胞部分DSP呈阳性表达。 4异体植入组组织学显示植入部位出现明显的炎症反应，中 央区域组织坏死，周围被结缔组织包绕，其内可见散在分布 的植入细胞，这些细胞免疫组织化学染色DSP呈阳性表达。 但细胞并未表现出基质分泌活性。 结论： 1 BM．MSCs易于获得并体外培养，并可通过脂质体基因转染 方法获得DMPl基因转染的骨髓间充质干细胞BM．MSCs． DMPl。 中文摘要 反应而需要进一步研究。 关键词：牙本质；牙本质基质蛋白l；骨髓间充质干细 胞；组织工程；牙齿 英文摘要 An on experimental