第十五章重组干扰素生产工艺.pptVIP

菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养 5、pH 值 干扰素生产工艺 发酵工艺过程 机械除泡和消泡剂共同使用 6、泡沫控制 干扰素生产工艺 发酵工艺过程 第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺 15.4.1 干扰素分离工艺过程 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性，即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯度最高值。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 15.4.1 干扰素分离工艺过程 菌体裂解 预处理 初级分离 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。 1、菌体裂解 一定的pH条件下，细胞破裂，加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 而获得。而pH 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 提供。在一定的pH 环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。  分离纯化工艺 干扰素生产工艺 加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片 进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎 片、DNA等进行沉淀。 离心： 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。 2、预处理 菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得不到澄清的蛋白质 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。 3、初级分离 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 初级分离溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装 15.4. 2 干扰素的纯化工艺过程 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 1、溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。 检查：缓冲液的pH值和电导值。 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 * * 第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺 15.1.1 干扰素的种类 15.1. 2 干扰素的临床应用 第一节 干扰素概述 15.1. 3 干扰素的生产工艺路线 干扰素生产工艺 干扰素概述 干扰素的发现 1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其它细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。 15.1.1 干扰素的种类 干扰素生产工艺 干扰素概述 1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。 两种病毒感染同一种细胞或机体时，常常发生一种病毒抑制另一种病毒复制的现象 概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类 似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的增殖 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ 干扰素-α有24种亚型，其中包括干扰素-α2a、干扰素-α1b、 干扰素-α2b、干扰素-α2c等 上市重组干扰素: α-2a、α-2b、α-1b、β-1b，γ 15.1.1 干扰素的种类 干扰素生产工艺 干扰素概述 干扰素的理化性质 143～166aa； MW:18 ～ 40 ku； pI:6.5 ～ 7